《Bioengineering & Translational Medicine》：BrAIn: A comprehensive artificial intelligence-based morphology analysis system for brain organoids and neuroscience
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这篇论文介绍了一个名为“大脑”（BrAIn）的深度学习应用工具，它能够全面、自动化地分析大脑类器官（brain organoids, BOs）的发育进程。BrAIn不仅能追踪其从拟胚体（embryoid bodies, EBs）的演化，量化面积、最大费雷特直径等关键形态参数，还能对三维类器官的正常、出芽和异常形态进行分类，并检测单层神经玫瑰花结结构。该工具旨在提供一个“无代码”界面，帮助不同技术背景的研究者轻松进行高级形态学分析，并评估了静态、振荡器和微流控芯片等不同生长条件对大脑类器官发育的影响，为神经发育研究、疾病建模和药物筛选提供了强大、用户友好的新工具。
引言
人类诱导多能干细胞（human-induced pluripotent stem cells, hiPSCs）及其衍生的类器官为生物医学研究带来了变革性潜力。其中，大脑类器官（brain organoids, BOs）在药物筛选、疾病建模和分子通路研究中具有重要价值。准确表征大脑形态至关重要，因为更复杂的类器官结构能更好地模拟人脑。尽管深度学习（deep learning, DL）和机器学习（machine learning, ML）方法已成为分析类器官形态不可或缺的工具，但用于全面、时间分辨评估的工具仍然稀缺。在此背景下，我们开发了基于深度学习的“大脑”（BrAIn）应用，旨在分析大脑类器官的整个发育过程。它被设计成一个易于使用的“无代码”界面，使不同技术背景的研究者都能轻松进行高级形态学分析。
材料与方法
细胞培养与分化
研究所用的人诱导多能干细胞（hiPSCs）由Tamer ?nder教授惠赠。hiPSCs在铺有1%胚胎干细胞（ESC）级别基质胶的6孔板中，使用mTeSR1培养基进行培养。细胞在达到80%汇合度时，使用ReLeSR以1:10的比例进行传代。所有培养和分化均在37°C、5%二氧化碳的条件下进行。
神经分化与大脑类器官发育
hiPSCs按照先前发表的协议分化为神经前体细胞（neural progenitor cells, NPCs）和大脑类器官。简言之，hiPSCs经ReLeSR脱离后，以9 × 103个细胞/孔的密度接种于低吸附U型底96孔板中，在添加了ROCK抑制剂和bFGF的hESCM培养基中形成拟胚体（embryoid bodies, EBs）。经过6天培养和后续的神经诱导培养基处理，EBs被包埋于基质胶中，随后转移至添加了维生素A的脑类器官分化培养基（cerebral organoid differentiation media, CODM）中，并分别置于微流控芯片、振荡培养和静态条件下进行长达48天的培养，期间定期更换培养基。
微流控芯片制备与免疫荧光染色
微流控芯片由多层聚甲基丙烯酸甲酯（poly(methyl methacrylate), PMMA）制成，通过激光切割和双面胶粘合组装。芯片经70%乙醇和紫外线照射灭菌。类器官在芯片中以35 μL/min的流速进行培养。为进行表型鉴定，EBs和BOs用4%多聚甲醛固定，并进行免疫荧光染色，使用针对神经前体细胞标志物SOX2和神经元标志物TUJ1的抗体，细胞核用DAPI复染，图像通过荧光显微镜和共聚焦显微镜采集。
数据集与模型训练
BrAIn的训练使用了五个数据集：用于分类部分的正常-异常和正常-出芽两类数据集；用于分割部分的时间依赖性BO和EB数据集；以及用于目标检测部分的玫瑰花结数据集。在分割部分的目标检测部分，使用了StyleGAN3模型进行数据增强。BrAIn包含三个核心部分：分类、分割和目标检测。
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分类：使用了五种预训练模型（DenseNet、Inception、ResNet50、VGG16、Xception）和五折交叉验证。
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分割：使用U-Net模型对BOs和EBs进行分割，同样采用五折交叉验证。
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目标检测：使用YOLOv8模型从2D细胞培养图像中检测神经玫瑰花结结构。
模型的具体超参数和架构详见表2。所有数据集均来自倒置显微镜，统计分析使用Python的scipy、stats、statsmodels库，绘图使用seaborn和matplotlib库。
结果
神经玫瑰花结与大脑类器官的表征
在微流控芯片、振荡培养和静态三种不同条件下生成的大脑类器官，均通过免疫荧光染色验证了其分化潜力，显示出神经前体细胞（SOX2阳性）和神经元（TUJ1阳性）的存在。同时，由hiPSCs衍生的拟胚体（EBs）经证实具有向三胚层（外胚层、中胚层、内胚层）分化的能力。神经玫瑰花结作为神经外胚层分化的关键结构，也通过免疫荧光染色验证了其结构完整性和分化潜力。
大脑类器官形态分类
形态是决定大脑类器官质量的关键。BrAIn的分类模块将类器官分为三个类别：正常（缺乏出芽但可接受）、出芽（存在出芽扰动区域）和异常（细胞未能建立EB所需的基本结构完整性）。在正常-出芽分类任务中，数据集包含60%正常和40%出芽样本，ResNet50模型取得了最佳性能，AUC、精确率和召回率分别为92.75%、83.58%和83.58%。在正常-异常分类任务中，数据集包含72%正常和28%异常样本，DenseNet121模型表现最优，AUC、精确率和召回率分别为96.83%、95.76%和95.76%。梯度加权类激活映射（Grad-CAM）热图可视化显示，模型在分类过程中重点关注了出芽区域、平滑边界或尖锐边界等关键形态特征。
大脑类器官分割与形态评估
为准确捕获大脑类器官的三维结构，在数据集创建过程中采用了Z-栈成像方法。使用本课题组开发的标注工具OrganoLabeler对EB和BO数据集进行标注。在EB形成过程中，基于4天内采集的图像开发了分割模型。为评估BO发育，在20至62天期间以7天为间隔采集图像。除了用于训练和内部测试的数据，还专门为BO和EB分割任务整理了一个独立的“分析数据集”。
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模型性能：在测试集上，使用EB数据集训练的U-Net模型取得了96.14%的平均交并比（Intersection over Union, IoU）和97.72%的平均Dice系数。对于BO数据集，初始U-Net模型的IoU和Dice系数分别为73.17%和77.55%。在使用StyleGAN3生成898张合成BO图像进行数据增强后，模型的性能显著提升，最终IoU和Dice系数分别达到98.85%和98.58%。
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拟胚体分析：对EB分析数据集（来自同一六孔板第1天和第4天的图像）的分析显示，从第1天到第4天，平均EB数量减少，而平均面积（从199.65 μm2增至572.28 μm2）和最大费雷特直径（从18.51 μm增至31.84 μm）增加，表明一些小EB可能合并形成了更大的结构。
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大脑类器官形态分析：对BO分析数据集进行分割后，提取了圆度、圆形度、面积、最大费雷特直径和周长等参数，用于时间依赖性的发育形态分析。基于主成分分析（Principal Component Analysis, PCA），面积、周长和最大费雷特直径对第一主成分（PC1）的方差贡献最大，且呈负相关。PCA图清晰显示了BO发育过程中的时间依赖性形态变化，以及不同生长条件（特别是微流控芯片系统）导致的聚类差异。
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生长条件影响：对面积变化的分析表明，振荡培养条件持续促进了正向的面积增长动力学。在微流控芯片条件下，初始正向增长在大约第34天后趋于稳定甚至略有下降。静态条件下的增长虽为正向，但始终低于振荡条件。最大费雷特直径的分析显示，振荡条件是唯一表现出规律增长且异质性最小的环境。周长测量在所有三种生长条件下，整个发育过程中未观察到显著差异。圆形度和圆度分析显示，在成熟阶段，微流控芯片系统中的形态异质性逐渐增加，而在振荡和静态条件下则观察到更急剧的增加。统计分析表明，生长条件对圆度有显著影响，特别是微流控芯片系统与静态条件之间存在统计学显著差异。
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外部数据集验证：使用Schr?ter等人发布的独立BO数据集对BrAIn进行验证，分割的Dice分数达到84%，形态分析结果与已发表结果一致，证明了BrAIn的可靠性和泛化能力。
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工具对比：与现有的类器官形态分析工具OrganoID、OrgaExtractor以及基础分割模型SAM（Segment Anything Model）进行比较。在BO数据集上，BrAIn（IoU 98.85%， Dice 98.58%）的表现显著优于OrganoID（IoU 35%， Dice 46%）、OrgaExtractor（IoU 2%， Dice 4%）和SAM（IoU 76.80%， Dice 85.42%）。在EB数据集上，BrAIn（IoU 96.14%， Dice 97.72%）也优于其他工具。
神经玫瑰花结检测
神经玫瑰花结是iPSC衍生神经元生成协议中的关键结构，在2D培养系统中难以用肉眼检测。BrAIn能够使用YOLOv8目标检测模型检测这些结构。初始使用80张图像训练时，模型取得了67%的平均平均精度（mean Average Precision, mAP）、62%的召回率和70%的精确率。通过使用StyleGAN3从真实数据生成293张合成图像进行数据增强后，模型性能大幅提升，最终达到96%的mAP、94%的召回率和98%的精确率。
讨论
形态是健康、功能性类器官的关键指标之一。理解、监测和控制类器官形态是该领域领先研究团队关注的焦点。大脑类器官的形态复杂性通常源于发育阶段的扰动，从而产生更接近天然脑组织的结构。扰动可以通过在不同的生长条件（如静态、动态3D培养）下进行发育或通过培养基改良来实现。三维特性使得大脑类器官可以在静态或动态培养条件下生长。振荡器和微流控芯片系统对大脑类器官发育的结构和功能特性具有积极影响，并能更好地在形态上模拟人脑。因此，更好地分析大脑类器官形态对于理解其功能特性至关重要。本研究开发的BrAIn工具能够分析和量化大脑类器官的发育过程，执行分类、分割和目标检测三项基本计算机视觉任务，是首个在三种不同培养条件下结合这些任务的计算工具。
尽管深度学习模型有助于湿实验室研究，但超越类器官分类的研究仍然有限。BrAIn成功预测了出芽-正常和异常-正常类别，AUC分别达到92.75%和96.83%。它能够分割小至拟胚体的三维细胞结构。BrAIn分割大脑类器官的平均IoU和Dice系数分别达到98.85%和98.58%。我们的工具通过面积、最大费雷特直径、周长、圆度和圆形度等参数评估了生长条件对时间依赖性类器官发育的影响。分割部分的数据增强是通过生成式AI模型StyleGAN3创建合成图像来完成的。
与包含Transformer模型的Swin U-Net相比，BrAIn模型在BO和EB分析数据集上表现更好，这可能是由于U-Net在小结构中局部特征提取和跳跃连接结构的优势。通过分割图像和测量形态参数，BrAIn揭示了动态3D培养条件（微流控芯片和振荡器）与静态培养相比的效果。动态3D培养刺激机械转导，提供更接近天然的微环境。我们为大脑类器官定制设计的微流控系统，通过受控的层流介质提供持续的剪切应力。与振荡器产生的湍流和静态条件相比，微流控芯片系统环境导致大脑类器官在所有发育时间点的形态参数在PCA图中形成不同的聚类。虽然圆度和圆形度对PCA图的最大方差有正向贡献，但尺寸测量呈负贡献。PCA1代表了类器官根据其物理尺寸的方差，我们发现尺寸测量在不同的生长条件下产生了一定的方差。
与文献中现有的工具相比，BrAIn具有显著优势。虽然一些工具声称具有通用性，但BrAIn在我们的数据集上表现更优。尽管像SAM这样的基础模型具有广泛的泛化能力，但对于器官和拟胚体等可能具有背景噪声的分层结构，其分割可能存在困难。器官和拟胚体图像可能未在SAM的大量训练数据中得到充分体现。而BrAIn因专门使用此类数据进行训练，可能在分割上更为成功。BrAIn为大脑类器官和2D神经元培养提供了全面的分析，但仍有少数局限性。孔板边缘附近的阴影可能会降低EB图像的分割性能。此外，对彼此接触的EBs的分割能力有限。这个限制可以通过改进训练数据集以包含更多此类图像来克服。另外，手动分割编辑功能被认为是BrAIn未来版本的一部分，使用户能够通过基于AI的分割和自定义修正实现最理想的分割。
与文献中许多专注于单一任务、或对非编码用户不够友好的工具不同，BrAIn具有简单的图形用户界面（Graphical User Interface, GUI），支持多种图像格式。在分割部分，用户可以输入显微镜的微米/像素转换因子，使形态测量能够以像素和微米为单位报告。分割后的类器官可以立即在GUI中查看。从分割图像导出的量化形态测量值会自动保存为Excel文件。检测到的玫瑰花结可以在GUI中查看，其在图像上的坐标可以保存为文本文件。据我们所知，BrAIn是首个在“无代码”界面中结合分类、分割和目标检测功能，用于分析不同培养条件下大脑类器官和拟胚体数据集的开源工具。
BrAIn的结果可能引领许多未来的研究。除了生长培养基的形态效应外，还可以整合组学分析，以更广泛地了解培养条件如何影响类器官的大小和形态。可以评估不同的生长培养基以确定类器官发育的最佳条件。各种微流控芯片设计和流速对类器官发育和产量有不同的影响，形态分析可以指导芯片设计的改进。由于不同的振荡器速度可能影响类器官的发育，通过BrAIn获取的图像有助于确定最佳振荡速度。
结论
BrAIn是一个强大的、基于深度学习的工具，用于自动、客观地分析大脑类器官图像。通过生成定量形态数据并实现跨不同实验条件的直接比较，它显著推进了大脑类器官研究，并加速了神经科学和医学领域的发现。此外，BrAIn用户友好的设计——无需编码专业知识——促进了对各种生长条件下类器官发育的全面评估，使其成为研究类器官生物学的一个多功能且宝贵的工具。
