角质形成细胞中维生素D受体与钙感应受体的缺失通过抑制DNA修复相关基因和氧化应激反应基因的表达，促进了表皮肿瘤的发生

维生素D受体(Vdr)与钙感应受体(Casr)缺失导致表皮细胞氧化应激和DNA修复能力下降，引发自发鳞状细胞癌。空间转录组学显示Vdr/Casr双敲除小鼠表皮基底层以上细胞及毛囊下段存在抗氧化酶和DNA修复基因表达下调，影响UVB诱导的DNA损伤修复及ROS清除，最终导致肿瘤发生。

　　

奥田由子（Yuko Oda）| 马克·B·迈耶（Mark B. Meyer）| 叶一伟（Iwei Yeh）| 林志云（Zhiyun Lin）| 黄基督（Christian T. Wong）| 奥丹尼斯（Dennis Oh）| 比克尔（Daniel D. Bikle）

美国加利福尼亚大学旧金山分校医学系及旧金山退伍军人事务医疗中心，加利福尼亚州旧金山

摘要

维生素D受体（Vdr）和钙感应受体（Casr）调控表皮细胞的增殖和分化。在表达Krt14的表皮角质形成细胞中同时删除Vdr和Casr会导致脱毛，并延缓伤口的再上皮化过程。本研究证实，DKO小鼠会随年龄增长自发出现鳞状细胞癌。我们探讨了Vdr/Casr缺失导致表皮肿瘤发生的分子机制。Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析显示氧化应激是Vdr/Casr缺乏引发生物学反应的主要途径。DKO角质形成细胞在肿瘤形成前就表现出参与氧化应激反应的基因表达降低。空间转录组学（Xenium）分析表明，皮肤表面基底上层表皮中活性氧代谢酶显著减少，这与Vdr/Casr缺失导致的分化缺陷一致。这种减少也出现在毛囊下部的细胞中，可能反映了表皮细胞向皮脂细胞的转变。DNA修复基因（如Xpc和Gadd45a）的表达在Vdr/Casr缺失后也有所下降，这些基因与表皮肿瘤发生有关。因此，DKO角质形成细胞的氧化应激反应能力受损，DNA修复能力减弱。Vdr/Casr的缺失延长了UVB诱导的活性氧生成，并延缓了UV诱导的嘧啶（6-4）光产物的清除。

引言

维生素D信号传导的抗肿瘤作用最早由Zinser等人证明：在给予7,12-二甲基苯并蒽（DMBA）后，85%的Vdr敲除小鼠在两个月内出现了皮肤肿瘤，而对照组则没有。这些肿瘤主要是乳头状瘤。随后，Ellison等人以及我们自己的团队也发现Vdr敲除小鼠在UVB照射后更容易形成肿瘤，这些肿瘤包括鳞状细胞癌（SCC）和基底细胞癌（BCC）。这些肿瘤并非自发产生，而是由化学物质或辐射引起的。然而，当我们在角质形成细胞中同时删除Vdr和Casr时，即使是在1岁的小鼠中，也观察到了肿瘤的自发形成。虽然相关研究持续时间较短，但我们未在仅缺失Vdr或Casr的小鼠中观察到肿瘤自发形成。钙信号传导和维生素D信号传导在表皮增殖和分化中的相互作用已被充分证实，其中Casr介导的钙信号传导增强了Vdr的促分化作用。因此，本研究选择了一个同时缺失Vdr和Casr的小鼠模型来探讨肿瘤形成的机制。

在之前的研究中，我们重点关注了三个对维生素D在表皮中的信号传导及增殖分化具有重要作用的通路：刺猬通路（Hh）、wnt/β-连环蛋白通路和透明质酸/CD44通路。这些通路都可能受到Vdr缺失导致的长非编码RNA表达变化的影响。

与当前研究更相关的是两条同样受维生素D信号传导影响的肿瘤形成通路：DNA损伤修复（DDR）和氧化应激。阳光是皮肤癌的主要诱因，其中95%的紫外线为UVA，5%为UVB。UVB（280-320纳米）会被表皮细胞中的DNA吸收，导致环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）和嘧啶（6-4）光产物（6-4PP）等特征性突变，若未得到修复，这些突变可能导致C到T或CC到TT的转变。UVA（320-400纳米）能够穿透真皮层，主要通过氧化反应造成DNA损伤。DDR是防止UVR和化学物质引起的DNA损伤产生固定突变的关键机制。核苷酸切除修复（NER）是在DNA复制开始前修复DNA损伤的主要方式。在NER过程中，XPC基因（受1,25(OH)2D诱导）与HRAD23B复合体共同作用，有时还涉及DNA损伤结合蛋白DDB1和2。Vdr敲除小鼠的表皮角质形成细胞在UVB照射后清除CPDs和6,4PP的能力降低，而1,25(OH)2D则能促进这些DNA损伤的清除。UVA引起的氧化应激会导致DNA氧化损伤，表现为8-羟基-2’-脱氧鸟苷和活性氧（ROS）的增加。在Vdr敲除小鼠中，结肠中的8-羟基-2’-脱氧鸟苷水平升高，而补充维生素D可以降低这一水平。1,25(OH)2D还能诱导癌细胞中多种抗氧化酶的产生，如硫氧还蛋白还原酶1、超氧化物歧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。

本研究评估了ROS和DDR在Vdr和Casr缺失小鼠角质形成细胞中肿瘤自发发生中的作用。结果显示，ROS生成增加，而DDR在基因表达和功能层面都受到抑制。

动物

通过将flxed Vdr小鼠（Vdr^rtm1Pcn Δex3-flox/flox，来自日本S. Kato）与flxed Casr小鼠（Krt14-Cre（Tg(Krt14-cre^{amctm1Wch）与Krt14-Cre小鼠交配得到的。双敲除小鼠（DKO）则是通过将同时携带flxed Casr和flxed Vdr的小鼠与Krt14-Cre小鼠交配创建的。}

在表达Krt14的表皮角质形成细胞中，同时删除Vdr和Casr基因会自发引发鳞状细胞癌

在表达Krt14的表皮角质形成细胞中同时缺失Vdr和Casr基因（DKO）的小鼠会随年龄增长（>12个月）自发出现皮肤肿瘤，而单Vdr敲除（KO）小鼠仅在UV照射或化学致癌物暴露后才会出现肿瘤。DKO小鼠表现出与Vdr KO小鼠相同的脱毛表型，并且会形成多个肿瘤，主要位于背部皮肤。例如，在一组14个月大的DKO小鼠中就观察到了多个肿瘤。

结论

在角质形成细胞中同时缺失Vdr和Casr的小鼠会随年龄增长自发出现鳞状细胞癌。这些基因的缺失导致基底上层表皮细胞中ROS代谢相关基因的表达显著下降，并降低DNA修复基因的表达。这些角质形成细胞清除UV诱导的ROS和修复UV诱导的DNA突变的能力减弱。随着年龄增长，其对环境压力的应对能力下降，导致突变积累，最终引发皮肤肿瘤。

作者贡献声明

Christian T. Wong：研究工作。 Dennis Oh：研究指导、数据分析。 Iwei Yeh：研究工作、数据分析。 Mark B. Meyer：研究工作、数据分析。 Yuko Oda：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、研究工作。 Daniel D. Bikle：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、研究指导、项目协调、资金申请、数据分析、概念构思。 Zhiyun Lin：研究工作。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢SFVA动物房的支援，以及Kim Sunhee博士对小鼠的精心照料。本研究得到了退伍军人事务部提供的资金支持（项目编号：1I01 BX005854）。

作者贡献

Bickle博士和Oda博士负责概念构思、数据分析及撰写；Oda博士负责研究工作；Bickle博士负责资金申请和项目管理；Meyer博士和Yeh博士负责数据分析；Lin女士和王先生提供了协助。

术语表

Casr

钙感应受体

DKO

钙感应受体和维生素D受体双重敲除

ROS

活性氧

6-4 PP

嘧啶-嘧啶酮光产物

SCC

鳞状细胞癌

TBHP

叔丁基过氧化氢

VDR

维生素D受体