α-酮戊二酸通过调节自噬途径，增强了谭氏绵羊颗粒细胞的增殖能力和类固醇生成能力

AKG调控绵羊卵巢颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素合成机制研究，发现5mM AKG通过激活mTOR信号通路增强自噬抑制，促进PCNA表达及EdU阳性细胞增加，同时降低BAX和pro-caspase3水平，提升CYP11A1/CYP19A1酶活性，促进雌二醇和孕酮分泌，为提高绵羊繁殖效率提供理论依据。

　　

王静华|王莉莉|赵梦琪|闵思瑞|严玉洁|何俊丽|宋红媛|刘新峰|陈强

宁夏大学生命科学学院，中国宁夏银川750000

摘要

α-酮戊二酸（AKG）是三羧酸循环中的关键中间体，可能影响哺乳动物的卵巢功能、卵母细胞成熟和胚胎发育。然而，它对颗粒细胞激素分泌的具体影响尚未明确。在这项研究中，我们使用EdU、CCK-8、qRT-PCR、Western blot和免疫荧光分析方法观察到AKG可以调节塔尼羊卵巢颗粒细胞的功能和类固醇代谢。研究结果表明，5 mM AKG处理显著促进了颗粒细胞的增殖，增加了增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白和mRNA的表达，并提高了EdU阳性细胞的比例。同时，AKG通过降低促凋亡蛋白BAX的表达、增加抗凋亡蛋白BCL2的表达以及抑制caspase3的激活来提高细胞存活率。此外，AKG显著增强了关键类固醇生成酶（CYP11A1、CYP19A1）的表达以及雌二醇和孕酮的分泌。进一步的研究表明，AKG通过调节自噬相关蛋白（LC3II/I、ATG7、Beclin1、P62）的表达、降低MDC荧光信号以及增强线粒体膜电位来抑制自噬。使用雷帕霉素（一种雷帕霉素通路抑制剂的机制靶点）进行的实验确认，AKG通过激活雷帕霉素信号通路的机制靶点来调节自噬，从而影响类固醇激素的合成。总之，这项研究首次揭示了AKG调节卵巢功能的分子机制，AKG通过促进增殖、抑制凋亡和自噬以及增强类固醇激素合成来优化颗粒细胞的功能，为改善卵泡发育和雌性动物生育能力提供了理论基础。

引言

代谢中间体已被认为是细胞过程的关键调节因子，其作用超出了传统的能量生产和生物合成功能。α-酮戊二酸（AKG）是三羧酸（TCA）循环中的关键代谢物，因其对细胞命运、表观遗传调控和应激反应的多种影响而受到广泛关注[1]、[2]、[3]、[4]。作为AKG依赖性双加氧酶（包括组蛋白和DNA去甲基化酶）的辅因子，AKG调节参与细胞增殖、分化和存活的基因表达模式[5]、[6]、[7]。此外，AKG还参与调节细胞氧化还原状态和能量代谢，最近的研究表明它可能影响卵母细胞成熟和早期胚胎发育等生殖过程[7]、[8]。然而，AKG调节卵巢颗粒细胞（GCs）功能的精确机制，尤其是在像羊这样的反刍动物中，仍不清楚。

自噬是一种高度保守的分解代谢过程，负责降解和回收细胞成分以维持体内平衡，已被确定为卵巢生理学中的关键调节因子[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。在颗粒细胞中，自噬在卵泡发育过程中动态调节：适度的自噬水平通过减轻代谢压力来支持颗粒细胞的存活，而过度的自噬则可能导致凋亡和卵泡闭锁。从机制上看，自噬与多种信号通路相互作用，包括mTOR（雷帕霉素的哺乳动物靶点）和AMPK（AMP激活的蛋白激酶）通路，这些通路也受到代谢中间体的调节。最近的研究表明，AKG可以通过影响mTOR活性或表观遗传修饰来调节多种细胞类型（如癌细胞和成纤维细胞）的自噬[14]、[15]。然而，AKG通过自噬调节颗粒细胞功能的机制及其涉及的特定分子机制仍需进一步研究，尤其是在羊的生殖背景下。

塔尼羊原产于中国宁夏，以其优质的肉质和耐逆性而闻名。然而，它们的低繁殖率（通常每胎仅产1-2只羔羊）限制了其经济潜力。增强卵巢功能，特别是颗粒细胞的健康和类固醇生成，是提高塔尼羊生育能力的一个有前景的策略。本研究探讨了AKG如何通过自噬调节塔尼羊卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡和类固醇激素生成，重点关注AKG在代谢和自噬中的作用，以及自噬在颗粒细胞功能中的重要性。这些发现有助于从分子水平理解羊卵泡发育的过程和机制，为改善卵泡发育和羊的繁殖效率提供理论基础，并为提高塔尼羊的繁殖性能提供策略。

实验设计

动物和伦理声明

本研究的动物实验方案已获得宁夏大学科学技术伦理委员会的批准，并按照其指南进行（批准编号：NXUA-2024–0156）。

实验方法

如图1所示，实验程序如下：从羊体内提取卵巢颗粒细胞，并设立三个组：对照组、AKG组以及AKG + Rapa联合处理组。处理条件如下：

AKG的使用浓度为

α-酮戊二酸补充促进卵巢颗粒细胞增殖

为了明确AKG对塔尼羊卵巢颗粒细胞增殖的影响，本研究将细胞暴露于不同浓度的AKG（0、5、25、50、100 mM）下，持续24小时和48小时。CCK-8细胞活力检测结果显示，5 mM AKG处理48小时后细胞增殖显著增加（p < 0.001，见图2.A-B）。Western blot分析进一步证实了这一结果。数据表明，AKG处理显著上调了增殖标志物的表达水平

讨论

本研究系统地阐明了AKG对塔尼羊卵巢颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素合成和自噬活性的调节作用。它还明确了AKG通过mTOR信号通路介导的自噬影响类固醇代谢的分子机制。这些发现为理解AKG在哺乳动物卵巢生理学中的作用提供了新的视角，并确定了改善卵泡发育的潜在营养靶点

结论

本研究探讨了AKG对塔尼羊卵巢颗粒细胞氧化应激、增殖、凋亡、线粒体功能和类固醇激素分泌的影响。我们的研究发现，AKG处理显著下调了促凋亡基因（如BAX、caspase3）的表达，同时上调了抗凋亡基因（如BCL2）的表达。EdU检测显示AKG处理组中的细胞增殖率显著增加。JC-1染色结果显示

作者贡献声明

王静华：撰写 – 原稿撰写、方法学设计、实验实施、数据分析、概念构建。何俊丽：方法学设计、数据分析。宋红媛：数据分析。刘新峰：撰写 – 审稿与编辑、监督。陈强：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学设计、资金获取。王莉莉：数据分析、概念构建。赵梦琪：方法学设计、实验实施。闵思瑞：数据分析、概念构建。严玉洁：

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：陈强报告称获得了宁夏回族自治区关键研究与发展计划的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了宁夏回族自治区关键研究与发展计划（人才引进专项项目）（项目编号：2024BEH04111）、国家自然科学基金（项目编号：32160791）和宁夏自然科学基金关键项目（项目编号：2024AAC02019）的支持。