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研究解析了中文鲈鱼促性腺激素（Gth）系统的分子特性与生理功能，发现fshb和lhb亚基均含单个N-糖基化位点，lhcgr2受体在性腺中特异性表达，并揭示雄性发育依赖受体敏化机制及激素信号的非经典通路调控。该成果为鱼类性别分化和繁殖调控机制提供了新证据。
刘世彦|黄文伟|马泽豪|郭建妮|周新成|史浩泽|龚建利|林浩然|陈松林|韩崇|李水生|孙彩云|张勇
中国南方海洋科学与工程研究院（珠海）生物控制国家重点实验室与生命科学学院，广东省水生经济动物重点实验室，广东省重要经济鱼类健康养殖工程技术研究中心，中山大学，广州，510275，中国
摘要
促性腺激素系统在调节硬骨鱼类繁殖中起着基础性作用。本研究描述了鲫鱼（Siniperca chuatsi）中Gth系统的分子特性和生理功能。序列分析显示，fshb和lhb亚基均具有一个N-糖基化位点。系统发育证据表明，lhcgr的复制发生在硬骨鱼类特有的全基因组复制事件之前。组织分布分析表明，lhcgr2严格局限于性腺组织，而lhcgr1则广泛分布于包括大脑和肝脏在内的多个器官中。此外，时空表达谱揭示了性腺发育过程中的关键调控机制。在分子分化阶段（孵化后15天），雄性鱼体内的fshr和lhcgrs显著上调，早于30天时的组织学性腺分化。在60天开始配子发生时，出现了明显的性别二态性。雌性发育的特点是垂体fshb显著增加，以促进卵泡形成。相比之下，雄性发育依赖于受体敏化机制，早期内源性雄激素上调性腺fshr和lhcgrs，从而维持到360天时的性成熟。实验性激素处理证实，雄激素诱导了偏向雄性的受体表达模式，而雌激素则抑制这一模式。总体而言，这些发现为鲫鱼雄性发育的内分泌调控提供了一个全面的模型。
引言
鲫鱼（Siniperca chuatsi）属于鲈形目（Perciformes）中的鲫科（Sinipercidae），是一种经济价值高的淡水鱼类，分布于黑龙江到珠江流域[1]。其高营养价值和无肌肉间刺的特点使其非常适合水产养殖。该物种表现出显著的性别二态性，雌性生长速度通常比雄性快15%–20%[2]。这种生长差异使得全雌性养殖成为提高养殖效率的理想策略。因此，分析鲫鱼性别决定和分化的神经内分泌调控网络对于阐明生长与繁殖之间的相互作用以及开发单性繁殖技术具有理论意义。
促性腺激素（Gths）是脊椎动物繁殖的核心调节因子，主要由垂体促性腺细胞分泌。它们包括卵泡刺激激素（Fsh）和黄体生成激素（Lh），这两种激素都是由一个共同的α亚基和一个激素特异性的β亚基（Fshb或Lhb）非共价连接而成的异二聚体糖蛋白[3]。结构研究表明，Gthb亚基含有12个高度保守的半胱氨酸残基，这些残基形成了稳定的半胱氨酸结结构，这是糖蛋白激素超家族和转化生长因子-β（TGF-β）家族共有的特征[4]。N-糖基化在Gths的生物活性、折叠、分泌和代谢清除中起着决定性作用。在大多数硬骨鱼类中，Fshb和Lhb亚基通常含有两个保守的N-糖基化位点[5]。然而，最近在鲤形目等类群中的研究发现位点数量存在差异，这表明结构差异可能与特定的繁殖策略和激素半衰期有关[6]。目前，鲈形目鱼类中Gths的糖基化特征和功能意义仍不甚清楚。
Gths通过与性腺细胞上的特异性受体结合来发挥其生理作用：卵泡刺激激素受体（Fshr）和黄体生成激素脉络膜促性腺激素受体（Lhcgr）。这些受体属于G蛋白偶联受体（GPCR）家族，具有多个富含亮氨酸的重复序列（LRR），负责特异性配体识别[7]。传统观点认为，硬骨鱼类像哺乳动物一样，只含有一个fshr和lhcgr基因拷贝。然而，基因组学进展在诸如日本鳗鱼（Anguilla japonica）、欧洲海鲈（Dicentrarchus labrax）和斑点鲶鱼（Lepisosteus oculatus）等物种中发现了第二个Lh受体（lhcgr2），从而完善了现有的受体进化模型。lhcgr基因复制的精确时间以及其后续亚功能化的机制一直是研究热点。来自早期分支辐鳍鱼类的系统发育证据表明，这一复制事件早于硬骨鱼类特有的全基因组复制（Ts-WGD）[9]，[11]。此外，鱼类Gth受体的配体识别特异性和下游信号转导表现出高度复杂性。与哺乳动物受体的高特异性不同，各种硬骨鱼类中的Lhcgrs对Fsh的激活具有广泛的亲和性[12]。关于信号转导，除了经典的cAMP/PKA通路外，哺乳动物Gth受体中的偏向性信号传导模式已被广泛证实[13]，[14]。越来越多的证据表明，硬骨鱼类Gth受体也利用MAPK/ERK和PI3K/AKT等非经典通路来介导特定的生理过程，如细胞增殖、存活和抗凋亡[15]，[16]，[17]。
尽管下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴在鱼类繁殖调节中的核心作用已得到证实，但Gth/Gthr系统如何精确调节性别二态性鲫鱼的性别分化和性腺发育的启动机制仍有待阐明。具体来说，雄性和雌性在早期发育过程中对激素信号的响应是否存在差异，以及新发现的双重lhcgr受体系统如何发挥作用，都是关键的科学问题。为了解决这些问题，本研究通过克隆鲫鱼的Gth和受体基因，并运用系统发育分析、时空表达谱分析、激素诱导的性别反转模型以及药理学受体表征来研究该系统的进化特征和调控机制。为了使实验设计与鲫鱼的生理过程相匹配，采样时间点是根据先前描述的性腺发育阶段选择的。组织学研究表明，原始生殖细胞大约在孵化后10天出现，形态学性别分化发生在10至30天之间[18]。在随后的性腺成熟过程中，60天后出现前卵母细胞，90天后开始早期精子发生，360天时达到完全性成熟[19]。基于这些发育特征，我们分析了三个主要阶段的性腺和垂体中的基因时空表达：早期性别分化（5–35天）、活跃的配子发生（60–180天）和完全成熟（360天）。此外，选择60天这一性腺成熟启动阶段进行激素诱导的性别反转实验，以评估生殖轴的分子反应。这些发现旨在为硬骨鱼类的繁殖策略多样性提供新的见解。
实验动物和组织取样
本研究使用的鲫鱼（Siniperca chuatsi）购自中国广东南沙的一家商业水产养殖场。所有实验对象均来自同一批次，以确保生理一致性，并在取样或处理前在循环淡水系统中进行适应。为了确保用于分子分析的生物材料质量，使用碎冰对鱼类进行深度麻醉，直至其失去反应能力。
促性腺激素及其受体的克隆和序列分析
以鲫鱼垂体cDNA为模板，利用基因特异性引物进行PCR扩增和测序，获得了包含fshb（363 bp）和lhb（447 bp）全长开放阅读框（ORFs）的DNA片段（图1. A, B）。同样，以性腺cDNA为模板并使用特异性引物（fshr-F/R、lhcgr1-F/R和lhcgr2-F/R），获得了包含fshr（2112 bp）、lhcgr1（2169 bp）和lhcgr2（2082 bp）全长ORFs的DNA片段（图1. C, D, E）。
讨论
cDNA序列的分子分析表明，鲫鱼的Fshb和Lhb亚基具有典型的糖蛋白激素结构特征。fshb开放阅读框（ORF）长度为363 bp，编码120个氨基酸，其信号肽位于1–18位；lhb ORF长度为447 bp，编码148个氨基酸，其信号肽位于1–24位。两个亚基都含有12个高度保守的半胱氨酸残基，这些残基形成了稳定的二硫键结构。
结论
本研究阐明了鲫鱼促性腺激素系统的分子和生理特征。序列分析显示，fshb和lhb亚基均具有一个N-糖基化位点。全骨鱼类基因组的系统发育数据表明，黄体生成激素脉络膜促性腺激素受体基因的复制发生在硬骨鱼类特有的全基因组复制之前。组织表达谱分析显示了受体显著的亚功能化。
未引用的参考文献
[68], [69], [70], [71], [72], [73], [74]
CRediT作者贡献声明
张勇：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源协调，项目管理，资金获取，概念构思。黄文伟：验证，方法学研究，数据分析，正式分析。孙彩云：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源协调，项目管理，资金获取，概念构思。刘世彦：撰写 – 初稿撰写，数据可视化，验证，方法学研究，资金获取，数据管理，概念构思。李水生：撰写 – 审稿与
致谢
本工作得到了中国国家重点研发计划（项目编号2024YFD2401500；2024YFD2401505）、广东省基础与应用基础研究基金（项目编号2024A1515013176）、贵州省科技规划项目（项目编号2023-085）、广东省科技规划项目（项目编号2023B1212060023）以及广州市科技规划项目（项目编号2025D04J0094）的支持。
