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蝌蚪虫甲壳矿化机制研究显示，无论摄入方解石还是文石，其外层甲壳均形成有序碳酸盐相，内层为方解石型无定形碳酸钙（ACC），整体XRD仅检测到方解石反射，表明生物矿化独立于饮食碳酸盐形态。
作者：龙波俊平（Shunpei Tatsunami）、冈田智（Satoru Okada）、山口康介（Kosuke Yamaguchi）、清野淳（Atsushi Kyono）
日本筑波大学生命与环境科学研究生院地球进化科学系，筑波305-8572
摘要
陆生等足类动物Armadillidium vulgare的背甲表皮具有层次分明的结构，其中含有碳酸钙矿物化成分，包括结晶态的方解石和非晶态的碳酸钙（ACC）。在本研究中，我们评估了不同形式的碳酸钙（方解石、文石）以及非碳酸盐物质（石英）对表皮矿物化过程及层状微观结构的影响。实验中，等足类动物在控制条件下分别以方解石、文石或石英为饲料进行饲养，其表皮通过扫描电子显微镜（SEM）、拉曼光谱（Raman spectroscopy）和同步辐射X射线衍射（XRD）技术进行了分析。SEM观察结果显示，以方解石或文石为饲料的个体其表皮明显增厚，并形成了矿化的层状结构；而以石英为饲料的个体则表现出较低的表皮矿物化程度。拉曼光谱分析表明，无论饲料中的碳酸盐来源是方解石还是文石，其内表皮始终含有方解石类型的ACC。相比之下，外表皮显示出更为有序的碳酸盐相结构，这可能是ACC向结晶方解石转化过程中的过渡状态。同步辐射X射线衍射分析显示，在所有饲养条件下，表皮样品中仅检测到方解石的衍射峰，即使在以文石为饲料的个体中也没有发现文石的衍射峰，这表明存在选择性的结晶过程。这些发现表明Armadillidium vulgare的表皮主要基于方解石构建，无论外部提供的碳酸钙形态如何，其表皮中的碳酸钙系统仍以方解石和方解石型ACC为主。这种不依赖于碳酸钙形态的ACC稳定化机制、层状有序的碳酸盐排列方式以及仅结晶方解石的特性，为了解陆生等足类的生物矿化机制提供了重要线索，并为未来关于表皮结构与功能中碳酸盐相演变的研究奠定了基础。
引言
数据可应要求提供。
生物矿化是生物体构建具有增强结构和机械性能的外骨骼的一种普遍策略（H.A. Lowenstam, S. Weiner，《生物矿化》，牛津大学出版社，纽约，1989年；Weiner和Addadi，2011年）。碳酸钙是最常见的生物矿物之一。在甲壳类动物中，它作为表皮的主要矿物成分，既起到保护作用，又为肌肉附着提供结构支撑。虽然大多数甲壳类动物生活在海洋环境中，但陆生等足类动物已成功适应陆地生活，并在其表皮矿化过程中展现出独特的适应性特征，以应对干燥和捕食等陆地环境压力（Ziegler，1996年；Hornung，2011年）。
在陆生等足类动物中，
Armadillidium vulgare是研究矿化背甲表皮的理想模型物种（Becker等人，2005年；Hild等人，2008年；Seidl等人，2012年；Yamagata等人，2022年）。早期的透射电子显微镜（TEM）研究表明，陆生等足类的背甲表皮由四层组成：最外层为表皮层（epicuticle），其次是外表皮（exocuticle）、内表皮（endocuticle）以及最内层的膜状层（Ziegler，1996年；Price和Holdich，1980年）。背甲表皮中含有59.8%的非晶态碳酸钙（ACC）、13.0%的有机基质、12.0%的方解石、10.7%的非晶态磷酸钙（ACP）以及少量水分（Becker等人，2005年）。扫描电子显微镜（SEM）和拉曼光谱分析显示，方解石和ACC在表皮中并非随机分布，而是分层存在：方解石主要存在于外表皮层，而ACC则主要分布在内表皮层（Hild等人，2008年）。Yokoo提出了外表皮中的两种结晶过程：一种是基于已有方解石晶面的外延结晶；另一种是通过有机基质介导的结晶（Yokoo，2012年）。研究表明，这些微小的方解石晶体（约10纳米大小）的c轴与周围的有机纤维平行排列（Yokoo，2012年）。随后，Seidl等人（Seidl等人，2012年）利用电子背散射衍射（EBSD）技术研究了方解石晶轴在表皮中的分布情况，发现方解石晶体呈随机取向，从而使表皮具有各向同性的机械性能。最近的研究通过纳米压痕和高分辨率光谱分析发现，从内层到表皮层机械性能的增强是由于碳酸钙结晶程度的增加，形成了具有高度分级保护性的表皮结构（Yamagata等人，2022年）。这些发现表明，背甲表皮是一种层次分明的生物复合材料，其结构和成分梯度赋予了其卓越的机械性能。
值得注意的是，非晶态碳酸钙（ACC）的溶解度远高于结晶态碳酸钙（Bre?evi?和Nielsen，1989年；Meiron等人，2011年）。因此，ACC既作为临时前体相转化为结晶相，又作为稳定相提供特定的机械优势（Yamagata等人，2022年）。具体来说，ACC的加入增强了矿化结构的韧性，形成了不同的硬度和刚度梯度，减少了脆性，同时提高了整体韧性。此外，ACC有助于在矿物-有机界面处有效重新分配应力并偏转裂纹，从而提高了机械载荷下的能量耗散能力和抗损伤能力（Yamagata等人，2022年）。
在此背景下，需要强调的是ACC具有“多态性”，即非晶态可以包含多种结构不同的形式。与结晶态的多态性不同，多态性是由短程有序性、水合状态和局部配位环境的变化引起的，导致非晶态具有不同的热力学稳定性和物理化学性质。先前的研究已经发现了ACC的原晶态变体，如原方解石型ACC和原文石型ACC，这些变体具有与其相应结晶态相似的短程结构特征，并对后续结晶过程具有重要影响（Cartwright等人，2012年）。这些研究表明，ACC由多种多态性组成，每种多态性都具有独特的结构特征。尽管ACC已被确认为
Armadillidium vulgare内表皮的关键成分，但目前尚缺乏对其多态性多样性的系统研究。
在陆地环境中，
Armadillidium vulgare主要从与地面直接接触的基质和食物中获取钙，这些来源中的碳酸钙通常以方解石和文石等结晶态存在。因此，摄入的钙的矿物学形式决定了生物矿化过程的初始物理化学条件。评估摄入阶段不同形式的碳酸钙的影响对于确定生物体是将所有膳食中的钙被动转化为单一的非晶态前体，还是在吸收钙和形成表皮的过程中选择性地处理不同形式的碳酸钙至关重要。基于实验的摄入方法为这一问题的研究提供了有效途径，因为仅分析完整的表皮无法判断ACC的特性是由内源性生物调控还是遗传的矿物属性决定的。通过系统地提供不同多态形式的碳酸钙，可以评估膳食中钙的矿物学形式是否影响表皮中ACC的结构组织、相分布和功能意义。
在本研究中，我们旨在阐明ACC在Armadillidium vulgare背甲表皮中的结构作用和功能多样性。为此，我们研究了不同外部碳酸钙来源对表皮矿物化和组织的影响，以确定Armadillidium vulgare在生物矿化过程中是否能够区分不同形式的碳酸钙。这项研究为理解陆生等足类的生物矿化机制和生理调控提供了新的见解。
采集与饲养条件
2024年9月，我们在日本茨城县筑波大学的棒球场采集了Armadillidium vulgare的样本。该地区环境湿润且温度适宜，有大量腐烂的树叶，是Armadillidium vulgare的理想自然栖息地。仅采集了活跃且健康的个体，以尽量减少环境因素的干扰。采集到的样本被转移到模拟其自然环境的饲养容器中。
表皮的微观结构特征
对Armadillidium vulgare背甲表皮的SEM观察显示，其表皮具有典型的层次分明结构。表皮清晰地分为四层：表皮层（epicuticle）、外表皮（exocuticle）、内表皮（endocuticle）和最内层的膜状层（图2a）。每一层都表现出与先前研究一致的特征形态（Hild等人，2008年；Seidl等人，2012年；Yamagata等人，2022年）。
结论
本研究表明，膳食中碳酸钙的结晶形态并不直接影响Armadillidium vulgare背甲表皮中沉积的碳酸钙相的短程结构。拉曼光谱分析在所有饲养条件下均检测到内表皮中存在方解石类型的ACC；同步辐射X射线衍射分析也仅检测到方解石的衍射峰。
未引用的参考文献
(Maslen等人，1993年)
CRediT作者贡献声明
龙波俊平（Shunpei Tatsunami）：数据可视化、资源管理、项目协调、方法设计、实验实施、数据分析、数据管理。
冈田智（Satoru Okada）：实验设计。
山口康介（Kosuke Yamaguchi）：实验实施。
清野淳（Atsushi Kyono）：论文撰写与修订、监督、资金申请、概念构思。
资助
本研究得到了Geo-Kagaku Center 2023年研究项目的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
我们感谢Kogure Toshihiro提供的宝贵意见和讨论。在KEK-PF的BL8B设施进行的同步辐射实验获得了Photon Factory项目顾问委员会（提案编号2023G044和2024G512）的批准。
关于生成式AI的使用声明
在撰写本手稿过程中，作者未使用任何写作辅助工具。所有内容均由作者亲自审阅和修改，作者对最终发表的研究成果负全责。
