《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Luteolin Disrupts Keratinocyte–Dendritic Cell Communication in Psoriasis by Targeting Rh Family C Glycoprotein
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本文研究发现，源自凉血解毒方（CBDF）的黄酮类化合物木犀草素（Luteolin）是Rh家族C糖蛋白（Rh family C glycoprotein, RHCG）的直接抑制剂。通过多模态计算和实验验证，该研究揭示了木犀草素通过下调角质形成细胞（KCs）中RHCG的表达，减少CXCL14的分泌，从而抑制下游树突状细胞（DCs）的活化，最终改善咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损。空间转录组学（STs）分析进一步证实，木犀草素可靶向DC富集的空间区域，并恢复银屑病皮损中失调的桥粒蛋白（如DSC2）表达。该工作为靶向RHCG轴治疗银屑病提供了临床前依据。
引言
银屑病是一种免疫相关的慢性炎症性皮肤病，全球患病率约为2%-3%，在中国有超过700万患者。其发病机制涉及白细胞介素-23（IL-23）/辅助性T细胞17（Th17）轴的失调、表皮屏障缺陷以及肥胖等环境触发因素。当前治疗手段包括外用药物（如维生素D3类似物和皮质类固醇）、光疗（以窄谱中波紫外线NB-UVB为一线）和系统治疗（如甲氨蝶呤MTX、IL-17/IL-23抑制剂等生物制剂）。然而，由于合并症、生物制剂耐药性及长期安全性问题，仍有30%-50%患者应答不足或复发，亟需个性化治疗方案。
在银屑病中，角质形成细胞（KCs）和树突状细胞（DCs）之间的密切“对话”是维持持续炎症和推动疾病进展的关键。KCs在应激或促炎因子刺激下分泌趋化因子和抗菌肽，招募并激活DCs。活化的DCs进而产生IL-23等细胞因子，极化初始T细胞向Th17分化。Th17细胞分泌的IL-17A/F和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）又进一步刺激KCs，形成恶性循环，放大核因子-κB（NF-κB）和信号转导与转录激活因子3（STAT3）信号，导致表皮增生和中性粒细胞浸润。靶向这一轴（如抗IL-23生物制剂）可有效中断炎症，凸显了其治疗价值。
中药在银屑病管理中的作用日益受到关注。凉血解毒方（CBDF）等复方具有多靶点效应。本研究团队前期工作已鉴定出Rh家族C糖蛋白（RHCG）是银屑病中连接KCs应激反应与KC-DC通讯的关键节点。RHCG可驱动KCs炎症，上调S100A蛋白和CXCL14的表达，后者通过CXCL14-CXCR4轴激活DCs，促进其成熟（LAMP3+）。本研究旨在系统探究CBDF的活性成分及其治疗银屑病的分子机制，重点关注其能否通过小分子调节RHCG中心通路，从而破坏KC-DC信号传导。
材料与方法
研究采用多学科方法验证木犀草素的作用。通过分子对接从CBDF五种成分中筛选出与RHCG（PDB ID: 3HD6）结合能最低的木犀草素。利用STRING数据库构建木犀草素相关靶点的蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，并通过Cytoscape和clusterProfiler进行网络分析与功能富集。采用CABS-flex v2.0和iMODS服务器进行分子动力学（MD）模拟，评估RHCG-木犀草素复合物的结构灵活性与稳定性。
细胞实验使用人永生化角质形成细胞HaCaT和人外周血来源的未成熟树突状细胞。通过CCK-8法检测木犀草素对HaCaT细胞活力的影响。采用细胞热位移分析（CETSA）结合蛋白质印迹法（WB）验证木犀草素与RHCG的直接结合。利用质粒转染在HaCaT细胞中过表达RHCG（oe-RHCG）。为模拟银屑病炎症环境，用M5细胞因子 cocktail（IL-6, IL-17, TNF-α, IFN-γ, oncostatin M，各10 ng/mL）刺激HaCaT细胞。通过非接触式Transwell共培养系统研究KC-DC通讯，并采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清中CXCL14、IL-23、IL-6的水平。
体内研究采用咪喹莫特（IMQ）诱导的C57BL/6J小鼠银屑病样模型。小鼠被随机分为模型组、空白对照组、木犀草素治疗组和甲氨蝶呤（MTX）阳性对照组。木犀草素（50 mg/kg）通过腹腔注射给药。每天对皮损进行银屑病面积与严重程度指数（PASI）评分。第7天处死小鼠，取皮肤和血清进行后续分析。
数据分析整合了来自基因表达综合数据库（GEO）的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（GSE151177）和空间转录组学（STs）数据（来自CROST数据库）。使用Seurat、Harmony、BayesSpace和SpaTopic等工具进行细胞注释、空间域识别和细胞通讯推断。通过AUCell评分法将木犀草素的潜在靶基因映射到scRNA-seq数据上，评估其细胞特异性。所有统计均使用GraphPad Prism进行。
结果
分子对接鉴定木犀草素为CBDF中靶向RHCG的关键成分
分子对接结果显示，CBDF五种成分与RHCG的结合能均低于-6.0 kcal/mol，其中木犀草素对接评分最优，提示其与RHCG可能存在较强相互作用。网络药理学分析获得了木犀草素的564个潜在靶点，构建的PPI网络显示关键靶点包括SRC、HSP90AA1、EGFR等。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析表明，这些靶点显著富集于蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、MAPK信号通路、化学致癌作用-受体激活等生物过程和通路。
分子动力学模拟结合CETSA证实木犀草素与RHCG的结合
分子动力学模拟通过均方根波动（RMSF）和正态模式分析（NMA）评估了复合物的稳定性。RMSF分析显示RHCG链A中第34位残基波动最大。NMA输出的变形性、B因子等图表进一步解析了复合物的全局运动模式。体外实验验证显示，木犀草素以剂量和时间依赖的方式抑制HaCaT细胞增殖，在10 μM浓度下处理24小时对细胞活力无显著影响。蛋白质印迹表明，木犀草素能以剂量依赖方式下调HaCaT细胞中RHCG蛋白水平。关键的CETSA实验证明，10 μM木犀草素处理可显著提高RHCG的热稳定性，其熔解温度（Tm）增加了约7.4°C，这为木犀草素直接结合并稳定RHCG蛋白提供了确凿证据。
木犀草素通过下调RHCG减轻KC炎症，进而阻止DC活化
对银屑病患者单细胞数据的分析显示，木犀草素的潜在靶点基因在银屑病皮损中表达更高，且主要富集于KCs、成熟调节性树突状细胞（mregDCs）和单核细胞。在KCs亚群中，木犀草素靶点与糖酵解相关基因的表达呈现共定位趋势，并且与RHCG、KRT16、KRT17、S100A12等银屑病相关炎症标志物的表达模式相似。体外实验证实，M5刺激可上调HaCaT细胞中糖酵解关键酶HK2以及角蛋白KRT16、炎症蛋白S100A12的表达，同时下调分化标志物KRT1，并增加细胞内乳酸水平。而过表达RHCG加剧了这些效应。木犀草素处理则能逆转M5或RHCG过表达引起的这些变化，降低糖酵解和炎症水平。
为了探究木犀草素对KC-DC通讯的影响，建立了Transwell共培养体系。将经过不同处理的HaCaT细胞与未成熟DCs共培养后发现，M5刺激或RHCG过表达的HaCaT细胞能显著激活DCs，表现为DCs成熟标志物LAMP3、CD80、CD86的表达上调，以及共培养上清中IL-23、IL-6和CXCL14水平的升高。重要的是，木犀草素预处理HaCaT细胞能够有效抑制这种DC活化效应，降低上述激活标志物的表达和细胞因子的分泌。这些效应在RHCG过表达的细胞中仍然存在，但被部分削弱，提示木犀草素的作用至少部分是通过靶向RHCG实现的。
木犀草素在体内改善银屑病样炎症并恢复表皮结构
在咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样模型中，木犀草素治疗显著改善了皮损严重程度。与模型组相比，木犀草素治疗组小鼠的PASI评分（包括红斑、鳞屑、浸润）明显降低，效果与阳性对照药甲氨蝶呤（MTX）相当。苏木精-伊红（HE）染色显示，木犀草素治疗逆转了IMQ引起的表皮增厚（棘层肥厚）、角化过度和真皮内炎性细胞浸润。多重免疫荧光染色进一步揭示，木犀草素能恢复银屑病皮损中表达下调的桥粒芯糖蛋白1（DSG1）和桥粒芯胶蛋白2（DSC2），这些蛋白对维持表皮细胞间粘附和屏障功能至关重要。这表明木犀草素不仅能抗炎，还能促进表皮结构的正常化。
空间转录组学解析木犀草素的作用空间靶点
为了在组织空间维度理解木犀草素的作用，研究对银屑病皮损的空间转录组数据进行了深入分析。通过BayesSpace将组织划分为不同的空间域，并鉴定出富含特定细胞类型（如DCs、KCs、T细胞）的区域。有趣的是，木犀草素靶基因特征在DC富集的空间域中评分最高，提示木犀草素的作用可能优先靶向这些免疫细胞活跃的微环境。此外，基于配体-受体对的分析推断，木犀草素处理可能调节了这些空间域之间的通讯网络。这些发现从空间分辨率层面揭示了木犀草素干预银屑病病理的潜在位点，为其组织特异性效应提供了新见解。
讨论
本研究通过整合计算模拟、体外实验、动物模型和空间组学，系统阐述了中药活性成分木犀草素治疗银屑病的新型分子机制。核心发现是木犀草素直接靶向RHCG，从而破坏KC-DC这一驱动银屑病炎症的关键轴心。机制上，木犀草素结合并下调RHCG，抑制KCs的炎症状态和CXCL14分泌，进而阻断经由CXCL14-CXCR4轴对DCs的激活信号，最终缓解全身性炎症。
研究的亮点在于多维度验证了靶点互作。从计算机模拟的分子对接和动力学，到体外实验的CETSA验证，提供了木犀草素与RHCG直接结合的有力证据。此外，利用前沿的空间转录组学技术，将木犀草素的效应定位到DC富集的特定组织区域，为理解药物在复杂组织中的空间作用模式提供了新思路。体内实验不仅证实了木犀草素的抗炎功效，还发现其能恢复表皮桥粒蛋白表达，提示其兼具抗炎和促进屏障修复的双重潜力。
当然，研究也存在一些局限。例如，木犀草素在共培养体系中是通过预处理KCs起效，其对DCs的直接作用尚未明确。此外，RHCG下游的具体信号通路，特别是其如何精确调控CXCL14等因子的表达，有待进一步探索。木犀草素是否影响银屑病中其他重要的免疫细胞（如T细胞、中性粒细胞）也值得未来研究。
总而言之，该工作不仅深化了对RHCG在银屑病中病理功能的理解，更重要的是将传统中药的有效成分木犀草素与现代疾病靶点RHCG直接联系起来，为开发基于RHCG靶点的银屑病精准治疗策略提供了坚实的临床前依据。木犀草素作为一种多靶点、兼具抗炎和修复作用的天然化合物，在银屑病的综合治疗中显示出良好的应用前景。
