《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：AJUBA: The Master Regulator Bridging EMT and Immune Evasion in Colorectal Cancer
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本文通过多组学与实验验证，系统揭示了AJUBA是连接EMT与免疫调控的关键分子。研究发现AJUBA在CRC中高表达，促进M2巨噬细胞浸润和VEGF/NOTCH信号活化，从而驱动肿瘤免疫逃逸。AJUBA高表达与淋巴结转移及不良预后显著相关，是CRC潜在的预后生物标志物和干预新靶点。
1. 引言
结直肠癌是一种在结肠上皮中异常细胞不受控制增殖的常见恶性肿瘤，是西方国家第三大最常见的癌症。其发生发展的核心过程之一是上皮-间质转化，这一过程促进了肿瘤细胞的侵袭、转移和治疗抵抗。为了系统地识别具有潜在临床意义的EMT相关基因，研究者整合了TCGA-CRC和多个GEO数据库的转录组数据集，应用机器学习和深度学习方法，最终从众多候选基因中一致鉴定出AJUBA，将其作为主要研究对象进行后续深入探究。
AJUBA是一种属于LIM结构域家族的肌动蛋白结合蛋白。在哺乳动物细胞中，AJUBA LIM蛋白可作为连接细胞黏附信号与核功能的胞质衔接子，从而促进上皮重塑。本研究旨在全面揭示AJUBA在结直肠癌中的表达模式、功能特征和预后相关性。
2. 材料与方法
研究纳入了90例福尔马林固定、石蜡包埋的结肠腺癌样本及匹配的癌旁正常组织，所有样本均来自滨州医科大学医院。临床病理分类和分期依据美国癌症联合委员会指南第七版进行。研究整合了TCGA-CRC、GSE18105、GSE22598、GSE89076和GSE110224等多个转录组数据集进行分析。单细胞RNA测序分析使用了GSE132465数据集，空间转录组分析使用了GSE225857数据集。
在基因筛选方面，通过差异表达分析并与dbEMT2数据库中的1184个EMT相关基因取交集，确定了12个候选枢纽基因。随后，利用超过10种机器学习算法和一个专门的深度学习算法，以TCGA-CRC队列为训练集，对候选基因进行评估。逻辑回归模型取得了最高的准确率，而SHAP值分析进一步强调了关键基因在CRC预测中的作用。综合机器学习和深度学习分析结果，AJUBA被一致确定为排名最高的基因。
实验验证方面，在临床样本中通过定量PCR、蛋白质印迹和免疫组化在mRNA和蛋白水平验证了AJUBA的表达。功能分析涉及siRNA介导的敲低实验，并评估了细胞增殖、迁移和侵袭、克隆形成能力以及异种移植模型中的体内肿瘤生长。免疫浸润通过ssGSEA和CIBERSORT算法进行评估。
3. 结果
3.1. 机器学习与深度学习鉴定CRC中的EMT相关基因
通过对多个CRC数据集的差异基因表达分析，并结合dbEMT2数据库的EMT基因集，筛选出12个潜在的枢纽基因。利用多种机器学习模型和名为NN-MLP的深度学习算法进行评估。在模型开发过程中，采用了10折交叉验证策略。逻辑回归模型取得了最高的准确率。NN-MLP模型的学习曲线显示了损失和准确率的变化。整合机器学习和深度学习的分析结果一致地将AJUBA确定为排名最高的基因，因此将其指定为后续研究的主要基因。
3.2. AJUBA的免疫浸润景观与巨噬细胞富集
基于ssGSEA和CIBERSORT算法的计算免疫基因组学分析显示，AJUBA表达与总巨噬细胞丰度呈显著正相关。当按AJUBA表达中位数对肿瘤进行分层时，在高AJUBA亚组中观察到更高的巨噬细胞浸润评分。同样，基于CIBERSORT的细胞反卷积分析表明，AJUBA与M0、M1和M2巨噬细胞亚群呈正相关。高、低AJUBA组之间的比较进一步证明，在高AJUBA肿瘤中M0、M1和M2巨噬细胞的比例显著增加。这些发现表明，AJUBA可能在结直肠肿瘤微环境中发挥促进巨噬细胞浸润或极化的调节作用。
3.3. CRC中单细胞水平的AJUBA表达模式分析
对GSE132465 CRC队列进行单细胞RNA测序分析，经过严格的质量控制、降维和基于图谱的聚类后，定义了12个主要细胞类型，包括树突状细胞、B细胞、上皮细胞、癌症相关成纤维细胞、内皮细胞、神经胶质细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、NK细胞、浆细胞和T细胞。细胞组成分析揭示了肿瘤组织和癌旁正常组织之间细胞分布的差异。正常组织样本中浆细胞、NK细胞、内皮细胞和B细胞富集，而肿瘤组织中T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和上皮细胞大量增加，突出了肿瘤微环境的异质性。
AJUBA在多种细胞谱系中均有检测到表达，包括CAFs、内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞、浆细胞、T细胞和B细胞。此外，配对组织类型之间的比较评估显示，与正常对照相比，CAFs、上皮细胞、NK细胞和浆细胞中的AJUBA转录本丰度显著升高。
3.4. AJUBA表达的空间转录组学分析
从CRC空间转录组数据集GSE225857中选择了四个肿瘤样本进行分析。经过质量控制程序后，空间转录组数据被标准化，并优化了聚类参数以实现精确的空间重建。空间聚类描绘了组织切片内的不同区域。AJUBA表达在空间上呈现出异质性，特别是在某些富含CAFs和上皮细胞的微区域中表达较高，这与免疫排斥龛的空间定位相吻合。空间转录组图谱进一步证实了AJUBA在肿瘤-基质交界区，特别是CAFs富集区域的共定位，这可能为AJUBA通过调节肿瘤微环境促进免疫逃逸提供了空间背景。
3.5. AJUBA在结直肠癌临床样本中的表达验证
在90对CRC临床样本中，通过免疫组化、定量PCR和蛋白质印迹在蛋白和mRNA水平验证了AJUBA的表达。结果表明，与癌旁正常组织相比，AJUBA在CRC组织中显著上调。此外，AJUBA高表达与更晚的淋巴结转移分期和更高的TNM分期显著相关，提示其与肿瘤进展密切相关。
生存分析显示，AJUBA高表达患者的总体生存期显著短于低表达患者。多因素Cox回归分析证实，AJUBA高表达是CRC患者总体生存的独立不良预后预测因子。
3.6. AJUBA在体外和体内模型中的功能研究
在HCT116和RKO细胞系中，通过siRNA敲低AJUBA的表达。功能实验结果表明，AJUBA敲低显著抑制了CRC细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力。在异种移植模型中，AJUBA敲低导致小鼠皮下移植瘤的生长受到抑制，肿瘤重量减轻，增殖标志物Ki-67表达降低。同时，肿瘤组织中M2巨噬细胞的丰度也显著减少。这些体内外实验证实，AJUBA在促进CRC恶性表型和调节肿瘤免疫微环境（特别是促进M2巨噬细胞极化）中起着关键作用。
3.7. AJUBA相关的信号通路分析
为进一步探究AJUBA的作用机制，研究进行了信号通路富集分析。结果显示，AJUBA高表达与VEGF信号通路和NOTCH信号通路的激活显著相关。这些通路已知在血管生成、EMT和免疫调节中发挥重要作用。AJUBA可能通过耦合EMT激活与促血管生成信号，形成一个促进肿瘤进展和免疫逃逸的恶性网络。
4. 结论
本研究通过整合多组学数据、空间转录组学以及系统的体内外功能实验，首次全面揭示了AJUBA在结直肠癌中的关键作用。AJUBA作为一个重要的EMT富集基因，在CRC中显著上调，其高表达与淋巴结转移和不良预后独立相关。在机制上，AJUBA通过促进M2巨噬细胞的浸润和极化，激活VEGF/NOTCH等信号通路，从而在肿瘤微环境中构建了一个有利于免疫逃逸的生态位。空间转录组学分析进一步揭示了AJUBA在免疫排斥龛，特别是CAFs富集区域的共定位。因此，AJUBA不仅是CRC一个有潜力的预后生物标志物，更是一个连接EMT与免疫调控的关键分子桥梁，为开发针对转移性CRC免疫排斥的新型治疗策略提供了新的靶点。
