抑癌新视角：NOL7通过稳定GADD45A mRNA失活STAT3信号通路抑制卵巢癌进展与血管生成

《Cancer Science》：NOL7 Inhibits Ovarian Cancer Progression and Suppresses Angiogenesis by Stabilizing GADD45A to Deactivate STAT3

本文揭示了NOL7在卵巢癌中的抑癌新机制。研究发现，NOL7在卵巢癌中表达下调，并与不良预后相关。功能上，NOL7过表达可抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡，并通过下调VEGF-A、上调TSP-1来抑制血管生成。机制上，NOL7作为RNA结合蛋白，与GADD45A mRNA的3‘UTR结合并增强其稳定性，进而通过抑制STAT3的Ser727位点磷酸化来发挥抗肿瘤效应。该研究为卵巢癌的靶向治疗提供了新的潜在靶点。

1 引言

卵巢癌是全球范围内最常见的妇科恶性肿瘤之一，其早期症状不明显且缺乏有效的筛查手段，导致多数患者确诊时已为晚期，五年总体生存率较低，严重威胁女性健康。因此，探索新的治疗靶点对改善卵巢癌的临床疗效至关重要。核仁蛋白7 (Nucleolar Protein 7, NOL7) 是一种新型RNA结合蛋白，已被鉴定为一种肿瘤抑制因子和关键的抗血管生成因子。既往研究显示，NOL7在宫颈癌等多种癌症中发挥抑癌作用，但其在卵巢癌中的临床意义和生物学功能仍不清楚。生长阻滞与DNA损伤诱导因子α (growth arrest and DNA damage inducible alpha, GADD45A) 是DNA损伤应答中的重要应激传感器，在细胞周期阻滞、凋亡和血管生成抑制中起关键作用。本研究旨在阐明NOL7在卵巢癌进展中的作用及其分子机制。

2 材料与方法

研究从中国医科大学附属盛京医院获取了卵巢癌组织、癌旁组织及石蜡包埋组织样本。使用了人正常卵巢上皮细胞系 (IOSE-80) 和多种卵巢癌细胞系 (OVCAR-8, OVCAR-3等) 以及人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)。通过构建NOL7野生型 (WT) 及其核定位序列 (nuclear localization sequences, NLS) 突变体质粒、shRNA进行基因操作。采用RT-qPCR、Western blotting、免疫组化 (Immunohistochemistry, IHC) 、免疫荧光 (Immunofluorescence, IF) 检测基因和蛋白表达。通过CCK-8、克隆形成、流式细胞术、TUNEL染色评估细胞活力、增殖、周期和凋亡。通过内皮细胞迁移、成管、球体出芽实验以及ELISA检测血管生成相关表型及因子 (VEGF-A, TSP-1)。利用裸鼠异种移植模型进行体内验证。通过mRNA测序 (mRNA-seq) 和RNA结合蛋白免疫共沉淀测序 (RIP-seq) 筛选下游靶基因，并通过RIP-PCR、双荧光素酶报告基因实验验证结合。使用STAT3抑制剂HO-8367进行功能挽救实验。统计分析使用GraphPad Prism 8软件。

3 结果

3.1 NOL7在卵巢癌中表达下调

对公共数据库 (GSE40595, GSE14407) 的分析及实验验证均表明，与正常组织相比，NOL7在卵巢癌组织和细胞系中的mRNA和蛋白表达水平均显著下调。临床样本免疫组化分析显示，NOL7低表达与更高的组织病理学分级、FIGO临床分期、TNM分期、远处转移和淋巴结转移显著相关。生存分析表明，NOL7低表达与卵巢癌患者较短的总体生存期相关。

3.2 NOL7调控卵巢癌细胞的增殖与凋亡

在OVCAR-3和SKOV-3细胞中过表达NOL7，可显著降低细胞活力，抑制克隆形成能力，阻碍细胞周期进程 (特别是G1/S期转换) ，并增加TUNEL阳性细胞数，表明NOL7过表达能抑制卵巢癌细胞增殖、阻滞细胞周期并促进其凋亡。

3.3 NOL7过表达抑制卵巢癌血管生成

将HUVECs与过表达NOL7的卵巢癌细胞条件培养基共培养后，HUVECs的迁移能力、成管能力以及球体出芽的数量和长度均受到显著抑制。ELISA检测发现，NOL7过表达降低了癌细胞上清中促血管生成因子VEGF-A的水平，同时提高了抗血管生成因子TSP-1的水平。使用重组VEGF (rVEGF) 和抗TSP-1抗体处理，可以逆转NOL7对HUVEC迁移和成管的抑制作用。

3.4 NOL7影响体内肿瘤生长与血管生成

在裸鼠异种移植模型中，过表达NOL7能显著抑制肿瘤的体积和重量。肿瘤组织免疫组化显示，NOL7过表达组中细胞增殖标志物Ki67表达降低，微血管标志物CD31阳性细胞数减少，且VEGF-A表达下降、TSP-1表达升高，证实NOL7在体内能抑制肿瘤生长和血管生成。

3.5 NOL7通过核转位调控卵巢癌恶性表型

NOL7的亚细胞定位对其功能至关重要。实验发现，野生型NOL7 (NOL7-WT) 和仅缺失NLS23的突变体 (ΔNLS23) 主要定位于细胞核/核仁，并能抑制细胞活力、促进凋亡、调节VEGF-A/TSP-1并抑制血管生成。而缺失所有三个NLS的突变体 (ΔNLS123) 则定位于细胞质，并失去了上述调控功能，证明NOL7的功能性核定位是其发挥抑癌作用的必要条件。

3.6 NOL7下游靶基因的鉴定

通过mRNA-seq和RIP-seq联合分析，并结合文献调研，鉴定出GADD45A是NOL7潜在的关键下游靶基因。RIP-seq显示NOL7的结合峰主要位于内含子区，其次为3‘UTR和外显子区。对血管生成相关基因的维恩图分析锁定GADD45A为候选靶点。

3.7 NOL7结合并稳定GADD45A mRNA

实验证实，GADD45A在卵巢癌组织和细胞系中表达下调，且其表达与NOL7水平呈显著正相关。RIP-PCR和双荧光素酶报告基因实验证明NOL7能够直接结合GADD45A mRNA的3‘UTR区域。NOL7-WT和ΔNLS23突变体能上调GADD45A的表达并增强其mRNA稳定性，而ΔNLS123突变体无此作用。体内实验也证实NOL7过表达可上调移植瘤中GADD45A的表达。

3.8 GADD45A是介导NOL7功能的关键效应因子

在过表达NOL7的卵巢癌细胞中敲低GADD45A，可以逆转NOL7对细胞活力的抑制、对凋亡的促进、对VEGF-A/TSP-1的调控以及对HUVEC迁移和成管的抑制作用，证明GADD45A是NOL7发挥抑癌功能的重要下游效应分子。

3.9 NOL7/GADD45A轴影响STAT3信号通路

机制探索表明，NOL7过表达可抑制转录因子STAT3在Ser⁷²⁷位点的磷酸化水平，而对Tyr⁷⁰⁵位点的磷酸化无显著影响。敲低GADD45A可逆转NOL7对p-STAT3 (Ser⁷²⁷) 、VEGF-A及凋亡相关蛋白Bcl-2/BAX的调控作用。另一方面，敲低NOL7可促进细胞活力、改变VEGF-A/TSP-1和Bcl-2/BAX的表达，而使用STAT3抑制剂HO-8367处理可逆转这些效应。这表明NOL7/GADD45A轴通过抑制STAT3 (Ser⁷²⁷) 的磷酸化来发挥抗肿瘤作用。

4 讨论

本研究系统阐述了NOL7在卵巢癌中的抑癌角色与机制。NOL7在卵巢癌中表达下调，且低表达预示不良预后。功能上，NOL7能抑制癌细胞增殖、促进凋亡，并通过调节VEGF-A/TSP-1平衡来抑制血管生成。其功能性核定位 (依赖NLS) 是发挥这些作用的前提。在分子机制上，NOL7作为RNA结合蛋白，直接结合并稳定GADD45A mRNA，进而上调GADD45A表达。GADD45A则通过抑制STAT3信号通路在Ser⁷²⁷位点的磷酸化，最终介导了NOL7的抗增殖、促凋亡和抗血管生成效应。该研究不仅揭示了一条新的NOL7-GADD45A-STAT3调控轴，也为将NOL7作为卵巢癌潜在诊断标志物和治疗靶点提供了理论依据。

作者贡献与基金

本研究由大连市生命健康领域指导计划等项目资助。所有作者声明无利益冲突。动物实验和临床样本收集均遵循相关伦理规范并获批准。