通过人工调控空位的铁单原子锚定碳材料：模拟亚硫酸氧化酶活性，实现高精度硫胺素检测与细胞识别

硫氧还蛋白氧化酶模拟材料Fe?@NC-DMOF的合成及其在维生素B1检测和细胞治疗中的应用。采用铁单原子锚定氮掺杂碳材料通过浸渍-热解法制备，具有低米氏常数和高催化活性，可在宽pH和高温下稳定工作。维生素B1竞争性抑制机制建立了高灵敏检测平台，并在抑制性钨酸钠处理的肝细胞中验证了其恢复酶活性的潜力。

　　

Fuying Zhu|Dong Wu|Yamei Lin

南京师范大学食品科学与制药工程学院，中国南京210023

摘要

亚硫酸氧化酶参与肝脏和肺部中有毒亚硫酸盐向硫酸盐的氧化过程，但其缺乏会导致亚硫酸盐水平升高，从而引发严重问题，如脑损伤和婴儿早死。目前尚无有效的治疗方法。在这项研究中，开发了一种富含羧基的铁单原子锚定N掺杂碳材料（Fe₁@NC-DMOF）。使用K₃[Fe (CN)₆]作为电子受体，Fe₁@NC-DMOF表现出优异的仿生SuO_x样活性，具有较低的米氏常数（K_m = 0.481 mM）和较高的最大反应速率（V_max = 19.42 μM min^-1）。此外，Fe₁@NC-DMOF在高温（100 °C）和宽pH范围（5-9）下仍具有出色的稳定性。硫胺素（VB1）可以与亚硫酸盐竞争，从而抑制Fe₁@NC-DMOF的SuO_x样活性。建立了一种高灵敏度和选择性的VB1比色检测平台。进一步在细胞水平上验证了Fe₁@NC-DMOF的SuO_x样活性，发现Fe₁@NC-DMOF可以恢复HepG2细胞中被钨酸钠抑制的亚硫酸氧化酶活性。这项工作不仅扩展了铁单原子纳米酶在生物传感中的仿生催化途径，还为生物医学领域亚硫酸氧化酶缺乏症的治疗提供了理论基础和潜在解决方案。

引言

亚硫酸氧化酶（SuO_x）是一种含钼的酶，主要位于肝脏和肾脏细胞线粒体的膜间隙中。¹ 在正常生理条件下，SuO_x利用细胞色素c（Cyt c）作为电子受体催化亚硫酸盐向硫酸盐的转化，这与含硫氨基酸（如半胱氨酸和甲硫氨酸）的代谢密切相关。², ³, ⁴, ⁵ SuO_x的缺乏会导致体内亚硫酸盐过度积累，引发严重的神经系统后果，包括脑损伤、智力障碍、神经损伤、婴儿癫痫发作和早死。⁶ 目前，尚无经济可行且有效的治疗方法。⁷, ⁸ 因此，SuO_x在人类健康和生物医学领域具有极其重要的应用价值。然而，天然SuO_x存在制备成本高、分离纯化困难以及稳定性差等问题。⁹, ¹⁰ 因此，迫切需要寻找SuO_x的有效替代品。

自2007年首次报道Fe₃O₄纳米颗粒具有过氧化物酶样活性以来，具有酶样活性的纳米酶（nanozymes）引起了极大兴趣。¹¹, ¹² 到目前为止，已经证明了纳米酶的各种催化活性，包括氧化酶、过氧化氢酶、水解酶、超氧化物歧化酶等。¹³, ¹⁴, ¹⁵, ¹⁶, ¹⁷, ¹⁸, ¹⁹, ²⁰, ²¹, ²², ²³, ²⁴, ²⁵, ²⁶, ²⁷, ²⁸, ²⁹, ³⁰, ³¹ 和过氧化物酶。³², ³³ 纳米酶已在生物传感、疾病诊断、肿瘤治疗和细菌感染治疗等领域得到广泛应用。³⁴, ³⁵, ³⁶, ³⁷ 然而，大多数关于氧化酶的研究集中在葡萄糖氧化酶和酚氧化酶上，而对SuO_x的模拟研究仍处于起步阶段。³⁸

目前设计SuO_x仿生体的方法主要集中在模拟其C末端钼蝶呤结合结构中的Mo活性位点。例如，ML-MoO_x、MoO₃和P-MoO_3?x等材料已被开发用于模拟亚砜氧化酶。³⁹, ⁴⁰, ⁴¹ 近年来，单原子材料表现出许多特性，如高原子利用率、优异的催化性能和明确的金属催化位点，使其成为酶仿生的理想候选者。⁴² 实际上，在天然酶中，过氧化物酶的活性中心是Fe-N₄。⁴³ 因此，铁单原子材料在酶模拟方面具有一定的优势。此外，与钼相比，铁具有更好的生物相容性、丰富的储量，并且成本低廉且易于获取。值得注意的是，目前仅有一项研究探讨了使用纳米酶治疗SuO_x缺乏症。Ruben Ragg等人开发了三氧化钼（MoO₃）纳米颗粒，可以在体外化学诱导SuO_x缺失的情况下恢复细胞的SuO_x活性。⁴⁰ 因此，开发具有SuO_x活性的铁单原子材料对于治疗SuO_x缺乏症具有重要意义。

在这项工作中，通过浸渍-热解策略和自组装过程合成了具有SuO_x样活性的铁单原子锚定N掺杂碳材料（Fe₁@NC-DMOF）。在高温煅烧过程中，DMOF中的羧基从芳香环上解离生成CO_x，这增强了缺陷的形成并调节了Fe和N的配位环境，从而提高了催化活性。使用K₃[Fe(CN)₆]作为电子受体，证明了Fe₁@NC-DMOF的仿生SuO_x活性。有趣的是，硫胺素（维生素B1，VB1）在还原性亚硫酸盐存在下会发生不可逆断裂，从而可能与Fe₁@NC-DMOF竞争亚硫酸盐，抑制其SuO_x样活性。基于此，构建了一个简单灵敏的纳米酶传感平台以实现VB1的快速检测。此外，Fe₁@NC-DMOF还可以恢复被钨酸钠抑制的HepG2细胞的SuO_x活性，进一步证实了其在细胞水平上的优异SuO_x样活性。这项工作不仅提供了一种使用铁单原子纳米酶检测VB1的新方法，还展示了其潜在的治疗应用，丰富了具有内在SuO_x样活性的纳米酶库。

结果与讨论

最初，采用浸渍-热解策略合成了Fe₁@NC-DMOF（图1a）。将硝酸锌和2-氨基对苯二甲酸溶解在DMF中，并加入三乙胺以促进在高温回流条件下的自组装过程，从而制备出DMOF。⁴⁴ 随后，将FeCl₃·6H₂O均匀分散在DMOF上，并在N₂气氛下进一步煅烧。在特定温度下，DMOF中的羧基从芳香环上解离生成CO_x，

结论

总结来说，设计了一种含有丰富缺陷的铁单原子锚定N掺杂碳材料（Fe₁@NC-DMOF），并通过XAFS测量技术确认了该铁单原子纳米酶的成功制备。Zeta电位测试表明Fe₁@NC-DMOF带有正电荷，这有助于其与亚硫酸盐底物的结合。此外，使用K₃[Fe (CN)₆作为电子受体，证明了Fe₁@NC-DMOF的优异SuO_x活性。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

本研究的支持数据可在本文的补充材料中找到。

竞争利益声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了江苏省高等教育机构自然科学研究项目（项目编号：24KJB530018）的支持。