《Cell Proliferation》：Single Cell Multi-Omics Revealing the Important Role of MR1 Mediated MAIT Cells in Maintaining Rejection for Liver Transplantation
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本研究首次通过单细胞转录组（scRNA-seq）、TCR测序、流式细胞术及多重免疫组化（mIHC）等技术，系统性阐明了粘膜相关恒定T细胞（MAIT）在肝移植（LT）排斥中的关键作用。研究发现，CD8+ MAIT细胞在移植肝脏中显著富集，与巨噬细胞等髓系细胞存在强信号关联，其亚群MAIT1和MAIT17呈现功能分化。小鼠模型证实，MR1基因敲除（MR1KO）导致MAIT细胞缺失，可显著减轻排斥反应，其机制在于MR1通过重塑移植后T细胞受体（TCR）谱库，促进克隆扩增，加剧排斥。该研究为理解移植免疫调控机制提供了新视角，并提示MR1-MAIT轴可作为潜在的干预靶点。
引言：肝移植免疫的复杂性与MAIT细胞的未解之谜
肝移植是终末期肝病最有效的治疗方法，术后免疫稳态对患者生存质量至关重要。移植后，供体来源细胞与受体免疫系统间的相互作用与协调是移植物被接受的关键。在复杂的移植免疫重塑过程中，粘膜相关恒定T细胞作为一种受主要组织相容性复合体I类相关蛋白1（MR1）限制的先天性T细胞亚群，因其独特的属性而备受关注。与常规T细胞不同，MAIT细胞表达半恒定的T细胞受体（TCR）α链，并识别基于维生素B代谢物的抗原。尤为重要的是，MAIT细胞在人类肝脏中优先富集，可占肝脏T细胞池的50%，并战略性地分布于胆管和门静脉束周围，充当一线防御屏障。尽管其在肝脏微环境中含量丰富，且在慢性肝病中作用已被证实，但MAIT细胞在肝移植急性和慢性排斥阶段的具体免疫调节机制仍未得到充分探索。
单细胞转录组学定义人肝移植中的CD8+ MAIT细胞
为了表征肝移植患者中的MAIT细胞，研究团队分析了17个样本的单细胞数据集，从图谱中筛选出46,117个CD8+细胞，并划分为10个簇。通过高表达KLRB1、SLC4A10、ZBTB16、RORA和RORC等经典标记物，研究者将簇2注释为MAIT细胞。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，CD8+ MAIT细胞内的差异表达基因（DEGs）主要涉及T细胞活化、分化、迁移及免疫、细胞毒性介导。细胞通讯网络分析表明，MAIT细胞与髓系细胞（如树突状细胞、库普弗细胞和巨噬细胞）存在广泛的相互作用。在排斥状态下，MAIT细胞在信号发送（如CXCR4、CXCR6、HLA）和接收（如TNF、IFNG、CCL5）方面均显示出增量趋势。对5615个MAIT细胞进行深度分析，可将其分为四个不同的亚簇，其中C2_CCL20+ MAIT簇更符合MAIT17特征。轨迹推断分析（CytoTRACE）提示，SLC4A10+ MAIT细胞可能代表分化程度较低的前体细胞池，而MAIT1和MAIT17亚簇则表现为更终末分化的效应状态。
识别人肝移植肝脏不同排斥状态下CD8+ MAIT标记物的表达
利用TCR Vα7.2和CD161，研究者在慢性排斥、轻度急性排斥和重度急性排斥的人肝组织中识别了MAIT细胞。空间分布上，急性排斥时MAIT细胞主要募集至门静脉区，而慢性排斥组织中，MAIT细胞更密集地聚集在血管和纤维间隔周围。这一组织学梯度与批量RNA测序分析结果一致，后者显示排斥样本中MAIT相关转录本显著上调。纵向监测显示，排斥患者外周血中MR1-四聚体+ MAIT细胞频率显著高于稳定受者，凸显了其作为潜在排斥生物标志物的临床相关性。
小鼠肝移植模型的建立与排斥状态评估
为了进一步探索MAIT细胞在肝移植排斥反应中的作用，研究者建立了一系列不同时间点的小鼠肝移植模型。苏木精-伊红染色显示，移植后存在显著的炎性细胞浸润和血管内皮剥脱。免疫组化分析证实CD8+ T细胞是主要的浸润细胞。移植后，各组织中T细胞比例发生重分布，肝脏中的浸润尤为明显。其中，CD4+ T细胞比例随时间逐渐下降，而CD8+ T细胞比例呈逐渐上升趋势。
小鼠肝移植模型中CD8+ MAIT细胞的动态变化
流式细胞术分析揭示了移植后小鼠各组织内CD8+ MAIT细胞的动态变化。在肝脏和脾脏中，CD8+ MAIT细胞比例在移植后1周和2周上升，3周达到峰值，4周下降，呈现一种延迟的动力学模式，提示其在排斥中发挥后续作用。相比之下，血液和淋巴结中的CD8+ MAIT细胞比例无显著时间差异。尽管CD4+ MAIT细胞也呈现相似趋势，但其在T细胞中的占比远低于CD8+ MAIT细胞，表明CD8+ MAIT细胞在肝移植排斥中占据主导地位。
MAIT细胞是小鼠肝移植中PD-1/PD-L1轴的潜在靶点
研究者重点关注了CD8+ MAIT细胞中程序性死亡蛋白1（PD-1）的表达。在肝脏中，无论是正常还是移植小鼠，PD-1的表达率都非常高，在移植组中接近100%。这提示了较低的免疫状态，可能易于发生排斥。对PD-1+ CD8细胞和髓系细胞中PD-L1的比例评估表明，肝脏中PD-L1水平也升高。PD-1在CD8+ T细胞和MAIT细胞间的表达存在差异，提示CD8+ MAIT细胞主要通过PD-1/PD-L1轴发挥免疫功能。相关分析显示，在脾脏中PD-1+ CD8+ T细胞与PD-L1呈负相关。
MR1KO小鼠肝移植模型减轻同种异体移植物排斥
为了阐明MAIT细胞在肝移植排斥中的作用，研究者利用C3H供体与野生型或MR1KO C57BL/6受体建立了小鼠模型。组织学评估显示，野生型对照组表现出更严重的门静脉炎症、更强的CD3+ T细胞浸润和CD8+细胞毒性积累。流式细胞术证实MR1KO受体中MAIT细胞缺失。细胞因子分析揭示了不同的MAIT亚群行为：MAIT17相关的IL-17A持续被抑制，而MAIT1相关的IFN-γ仅在移植后2周短暂下降，提示MAIT17参与急性排斥。颗粒酶B在MR1KO小鼠各组织中均持续下调，表明细胞毒性反应系统性地受损。免疫表型分析显示，MR1KO受体在移植后1周T细胞浸润减少，CD8+细胞优先缺失，CD4+细胞积累增加，这与更轻度的排斥相关。值得注意的是，调节性T细胞在野生型肝脏中于移植后扩增，而MR1KO小鼠表现出更优的Treg扩增，尤其是在肝脏和脾脏中。体外共培养实验进一步证实，MAIT细胞通过分泌促炎细胞因子（特别是IL-17A和IFN-γ）发挥对肝细胞的细胞毒性作用。
单细胞转录谱揭示MR1KO肝移植受体中免疫亚群的重塑
对肝移植物进行单细胞RNA测序，注释了七大谱系。与野生型相比，MR1KO受体中T细胞频率降低，表明排斥反应减弱。从T细胞中鉴定出21个转录学上不同的亚群。UMAP可视化显示了基因型特异性的T细胞状态分布：MAIT细胞是野生型受体中的主要亚群，而MR1KO移植肝中显示出扩增的Treg浸润。相关性热图分析表明MAIT细胞与中央记忆T细胞之间存在显著的负相关关系。差异表达基因的GO和KEGG通路富集分析揭示了与T细胞活化、IL-17信号和移植排斥相关的通路，表明MR1缺乏通过调节T细胞效应和抗原提呈网络来减轻排斥。配体-受体分析显示野生型受体具有更强的信号传递概率，其中MHC-I介导的相互作用占主导，而MR1KO移植物保留了较少的检查点信号。
TCR谱库改变揭示MR1KO减轻小鼠肝移植排斥
单细胞TCR测序分析显示，与野生型相比，MR1KO小鼠拥有显著更高比例的独特TCR克隆，尤其是在移植后2周，表明在缺乏MR1的情况下克隆扩增受限。谱库空间分析进一步显示，MR1KO的谱库偏向于低频克隆，而野生型组在移植后2周时被更大的克隆型主导。克隆丰度曲线证实野生型组有更多高频克隆且多样性降低，这与更强的排斥反应一致。尽管各组间的CDR3长度分布相似，但多样性指数显示野生型组在移植后2周时香农指数、逆辛普森指数等显著降低，而MR1KO组在移植后1周时保持了最高的克隆丰富度和均匀度。克隆共享分析显示，MR1KO与野生型组在移植后2周时克隆重叠极少。单细胞TCR谱分析表明，MR1KO小鼠未能形成朝向效应亚群的大型密度热点。广泛的TCR克隆共享见于T细胞亚群之间，特别是MAIT、效应T细胞、增殖性T细胞和辅助性T细胞1之间，表明MAIT细胞的活化增强了效应反应并放大了急性移植物排斥。
讨论与展望
本研究首次描绘了MAIT细胞在小鼠肝移植模型中的动态变化，揭示了其在肝移植排斥中的关键作用。利用MR1KO模型进一步验证了MAIT细胞缺失可减轻排斥。在单细胞水平，通过分析移植免疫微环境重塑过程中TCR克隆型的变化，探索了其减轻排斥的机制。研究发现，在肝移植免疫微环境中，MAIT细胞通过MR1快速活化，释放IFN-γ、IL-17A、颗粒酶B等因子加剧组织损伤，并通过影响TCR谱库重塑，促进单一优势克隆的明显扩增、降低克隆多样性，从而加剧排斥反应。MR1-MAIT轴可作为监测肝移植后免疫状态的标志物。几乎所有的MAIT细胞都高表达PD-1，使其可能成为PD-1/PD-L1阻断的潜在治疗靶点。通过单细胞TCR追踪，研究不仅建立了MAIT细胞作为排斥关键驱动因素的因果联系，更重要的是揭示了其作为连接先天性与适应性免疫桥梁的深刻免疫调节功能。然而，研究也存在局限性，例如尚未探索转录因子在MAIT细胞中的功能作用，以及其在移植免疫微环境中的发育和分化轨迹，急性和慢性排斥中是否存在不同的MAIT细胞活化主导机制也有待阐明。总之，该研究揭示了MAIT细胞在肝移植排斥中的关键作用及其通过影响TCR谱库重塑诱导排斥的核心机制，为未来通过监测MAIT细胞频率和MR1活性来评估临床患者排斥发生风险，以及通过调控MR1-MAIT轴来干预排斥，提供了新的策略基础。
