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本研究通过代谢工程改造Pseudomonas putida KT2440，使其能够利用混合糖（葡萄糖/木糖）高效生产先进航空燃料候选物DMCO（1,4-二甲基环辛烷）的关键前体——醋酸异戊烯酯。研究人员通过引入异源醇乙酰基转移酶（ATF1）、敲除内源性酯酶以减少产物降解，整合木糖异构酶通路并敲除全局调控因子crc和hexR以缓解碳代谢物阻遏，同时增强乙酰辅酶A通量。该工作最终在补料分批生物反应器中实现了1.9 g/L的醋酸异戊烯酯产量，验证了P. putida作为从木质纤维素原料规模化生产酯基生物燃料的强大微生物底盘潜力。
开发可持续的先进航空燃料是航空业脱碳的关键。许多有前景的生物基燃料前体，如异戊二烯，在微生物生产中存在毒性和下游回收困难等问题。而异戊二烯醇的醋酸酯衍生物——醋酸异戊烯酯，因其较低的溶解度和更高的燃料性能，成为一种更具优势的生物合成前体。它可以被化学合成为高能量密度的航空燃料1,4-二甲基环辛烷。然而，高效的微生物生产平台是关键。本研究选择了极具潜力的微生物宿主——恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440，它代谢灵活，能耐受木质纤维素水解液中的抑制物，是生物质转化的理想平台。但利用P. putida生产醋酸异戊烯酯面临几大挑战：宿主无法天然利用木质纤维素中第二丰富的木糖；存在碳代谢物阻遏，影响葡萄糖和木糖的共利用；细胞内乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）的可用性较低，限制了酯化效率；以及内源性酯酶可能导致产物降解。为了克服这些障碍，构建一个能够高效转化混合糖为醋酸异戊烯酯的P. putida工程菌株，研究人员开展了一项系统的代谢工程研究，相关成果发表于《Metabolic Engineering Communications》。
研究人员主要应用了以下关键技术方法：1) 分子克隆与基因工程：利用NEBuilder HiFi DNA Assembly进行质粒构建，通过同源重组和基于CRISPR/Cpf1 (dCpf1-D917N) 的基因组编辑技术进行基因敲除和整合。2) 菌株培养与发酵优化：在摇瓶和2L补料分批生物反应器中进行培养，系统优化了培养基组成、诱导时机、覆盖溶剂等参数。3) 分析化学技术：采用气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）定量醋酸异戊烯酯和异戊二烯醇，采用高效液相色谱（HPLC）分析葡萄糖和木糖。4) 蛋白质组学分析：使用基于数据非依赖性采集（DIA）的质谱技术与DIA-NN软件进行无标记定量蛋白质组学分析，评估蛋白质表达水平。
研究结果
3.1. 在P. putida中生产醋酸异戊烯酯
研究人员以一个经过改造、可生产异戊二烯醇的P. putida菌株PIPA为出发菌株。该菌株已删除了多个竞争途径基因（phaABC, mvaB, hbdH, ldhA和一个86 kb的亮氨酸降解区域），并通过质粒pIY670表达异源的IPP-旁路甲羟戊酸（MVA）途径，以提供异戊二烯醇前体。为了将异戊二烯酯化为醋酸异戊烯酯，研究人员测试了五种醇酰基转移酶（AAT）。结果表明，来源于酿酒酵母（S. cerevisiae）的ATF1效果最佳，在摇瓶培养中可使工程菌PIPA-AAT1从20 g/L葡萄糖生产出405 mg/L的醋酸异戊烯酯。
3.2. 防止产物降解
研究发现野生型P. putida KT2440能够降解外源添加的醋酸异戊烯酯。为了减少这种水解，研究人员结合CRISPR/dCas9（CRISPRi）基因敲低和质粒过表达筛选，鉴定出三个关键的内源性酯酶：PP_1127、PP_3812和PP_4218。在PIPA菌株中逐一或组合敲除这些酯酶基因。结果表明，三敲除菌株PIPA-E3在摇瓶中生产醋酸异戊烯酯的产量达到724 mg/L，比未敲除酯酶的对照菌株提高了1.7倍，并且显著减少了异戊二烯醇的积累，证明敲除这些酯酶有效增强了产物的稳定性。
3.3. 优化途径表达和产物回收
研究优化了诱导条件和产物回收策略。对于表达ATF1的诱导剂水杨酸（SA），250 μM的浓度可获得最高产量。在培养早期指数期（OD6000.6–0.8）同时添加阿拉伯糖（Ara，诱导pIY670）和SA，可获得最佳产量。在评估的几种覆盖溶剂中，十二烷和Durasyn 164聚α烯烃在摇瓶规模下表现良好，其中Durasyn因其化学稳定性和低成本，更适合大规模应用。
3.4. 引入木糖利用途径
为利用木质纤维素水解液中的木糖，研究人员将异源木糖异构酶途径（包含xylE, xylA, xylB, talB, tktA基因）整合到PIPA菌株的gcd基因位点，并敲除gcd以防止木糖氧化，构建了菌株PIPAxyl。在优化了预培养介质和碳氮比后，PIPAxyl-AAT1菌株能在含混合糖的培养基中生长并生产醋酸异戊烯酯，但产量较低。结合上述三个酯酶的敲除（得到PIPAxyl-E3菌株），产量提升至383 mg/L。为了进一步改善葡萄糖和木糖的共利用，研究人员敲除了两个全局碳代谢调控因子crc和hexR，以缓解碳代谢物阻遏（CCR）。双敲除菌株PIPAxyl-E3-K3的醋酸异戊烯酯产量进一步提高至599 mg/L。蛋白质组学分析证实，crc和hexR的缺失上调了中心碳代谢中多种关键蛋白的表达。
3.5. 重构天然和合成途径以增强乙酰辅酶A通量
为增加醋酸异戊烯酯生物合成所需的关键前体乙酰辅酶A的供应，研究人员测试了多种基因的过表达。初步筛选发现，过表达内源的rpe（核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶）以及异源的acsEc（大肠杆菌乙酰辅酶A合成酶）和xfpkBa（青春双歧杆菌磷酸酮醇酶）能提高产量。最终，将acsEc和xfpkBa作为一个操纵子，在优化了核糖体结合位点（RBS）强度后，整合到PIPAxyl-E3菌株的染色体上，得到菌株PIPAxyl-E3-O15。在进一步优化了培养基和诱导条件后，该菌株在摇瓶中产量达到819 mg/L。最后，整合了所有优化策略（酯酶敲除、调控因子敲除、乙酰辅酶A途径增强）的最终菌株PIPAxyl-E3-K3-O15，在葡萄糖与木糖比例为2:1的混合糖培养基中，摇瓶产量达到1.5 g/L，相比初始菌株提高了8.3倍。
3.6. 补料分批培养中的醋酸异戊烯酯生产
为了验证规模化生产的潜力，研究人员在2L生物反应器中对最终菌株PIPAxyl-E3-K3-O15进行了补料分批培养。初始糖浓度为13.3 g/L葡萄糖和6.7 g/L木糖，通过连续补料将残糖浓度维持在5 g/L以下。经过约160小时的培养，该菌株消耗了28.0 g/L葡萄糖和12.5 g/L木糖，最终在生物反应器液相和尾气捕集溶剂中总计生产了1.9 g/L醋酸异戊烯酯，对应总糖消耗的得率为0.067 g/g，达到理论最大得率的18.1%。
研究结论与意义
本研究成功地对P. putida KT2440进行了多层次的代谢重塑，使其能够高效地将木质纤维素来源的混合糖（葡萄糖和木糖）转化为先进航空燃料DMCO的前体——醋酸异戊烯酯。研究通过引入异源ATF1酶实现酯的合成，敲除三个内源性酯酶以减少产物降解，整合木糖异构酶途径并删除全局调控因子Crc和HexR以缓解碳代谢物阻遏、促进糖共利用，并通过过表达acs和xfpk来增强细胞内乙酰辅酶A通量。结合系统的培养条件优化，最终构建的高产菌株在摇瓶和补料分批生物反应器中分别实现了1.5 g/L和1.9 g/L的醋酸异戊烯酯产量。
这项工作首次在P. putida中实现了醋酸异戊烯酯的生产，充分展示了P. putida作为一个强大且可扩展的微生物底盘，在利用木质纤维素等可再生原料生物合成高附加值酯类化合物方面的巨大潜力。该研究不仅为生产先进生物航空燃料提供了一条有前景的技术路径，其采用的综合代谢工程策略（包括途径构建、产物稳定性优化、碳代谢调控解除和辅因子工程）也为利用P. putida生产其他乙酰辅酶A衍生化合物提供了宝贵的范例和见解。
