独立于PAM的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法结合过滤技术，用于现场检测新鲜切开的甜瓜中的鼠伤寒沙门氏菌

《Microchemical Journal》：PAM-independent RPA-CRISPR/Cas12a assay integrated with filtration for on-site detection of Salmonella Typhimurium in fresh-cut melon

基于T7外切酶的PAM独立RPA-Cas12a检测系统可快速灵敏检测新鲜切瓜中肠出血性弧菌。该系统通过外切酶处理消除双链DNA的PAM依赖限制，结合过滤浓缩步骤将检测灵敏度提升10倍，适用于现场即时诊断。

作者：So-Hyeon Ji | Se-Wook Oh

韩国国立大学食品与营养系，首尔136-702

摘要

鼠伤寒沙门氏菌是一种主要的食源性病原体。在新鲜切开的瓜类中，鼠伤寒沙门氏菌可能在加工和食用过程中引起感染。这突显了快速现场检测的必要性，以确保食品安全。重组酶聚合酶扩增（RPA）与规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白12a（Cas12a）的组合已被越来越多地用于核酸检测。然而，标准的CRISPR/Cas12a系统需要双链DNA上的原间隔序列（PAM），这限制了目标序列的选择并限制了检测设计的灵活性。本研究通过引入T7外切酶处理作为扩增后的步骤，开发了一种不依赖PAM的RPA-CRISPR/Cas12a检测系统，以克服PAM的约束并提高对鼠伤寒沙门氏菌的检测灵活性。T7外切酶可以降解RPA产物，暴露目标序列，从而实现不依赖PAM的识别和Cas12a的切割活性。这种方法有助于crRNA和引物的设计，提高了CRISPR的靶向灵活性。此外，研究还整合了过滤步骤，以提高低细菌浓度食品样本的检测灵敏度。过滤将检测灵敏度提高了10倍，从10⁵ CFU/g降低到10⁴ CFU/g（在添加了鼠伤寒沙门氏菌的瓜类样本中）。因此，使用不依赖PAM的RPA-CRISPR/Cas12a结合过滤技术，为新鲜切开瓜类中鼠伤寒沙门氏菌的快速现场检测提供了一个综合平台。

引言

鼠伤寒沙门氏菌是食源性疾病的主要原因，经常与各种食品相关的疫情有关[1]。尽管感染主要与禽类和肉类来源有关，但新鲜农产品（如水果和蔬菜）也被认为是重要的传播源。这些食品通常生食或经过最小程度加工，在处理过程中容易发生交叉污染，从而容易受到细菌污染[2]、[3]。2023年11月，受沙门氏菌污染的瓜类感染了407人[4]。瓜类的粗糙网状果皮表面有利于细菌附着和侵入；随后的切割操作可能会将沙门氏菌等病原体转移到内部果肉[5]、[6]。为了防止疫情爆发和保护公众健康，快速检测沙门氏菌对于减少新鲜切开瓜类中的食源传播至关重要。

传统的基于培养的方法检测鼠伤寒沙门氏菌既耗时又费力。虽然聚合酶链反应（PCR）具有高灵敏度和特异性，但其对热循环器的依赖性限制了其在现场诊断中的应用[7]。而在重组酶聚合酶扩增（RPA）中，扩增在37°C–42°C下进行，无需热循环，为PCR提供了一种更简单、更快速的替代方案[8]。这些特点使得RPA在即时检测或现场诊断中具有优势[9]。

近年来，规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关系统（Cas）由于其高特异性和设计灵活性，已成为强大的核酸检测工具[10]、[11]。这些技术在食品安全监测中显示出巨大潜力，通过基于核酸扩增的方法和基于亲和力的生物传感策略，开发出了高度敏感和特异的检测方法[12]。与凝胶电泳和实时PCR等依赖仪器的检测方法不同，基于CRISPR的检测方法更为简单。这些检测方法可以与荧光报告基因结合，并使用便携设备（如紫外线灯和LED透射仪）进行可视化，从而实现现场应用。它们与RPA等等温扩增技术的兼容性提高了便携性；其高特异性降低了假阳性的可能性，进一步提高了诊断的可靠性[13]。

然而，CRISPR/Cas12a在这些平台中的应用受到双链DNA上原间隔序列（PAM）要求的限制，PAM是启动目标识别和切割所必需的[14]。对PAM的依赖对检测开发构成了重大限制，因为只有部分基因组区域包含理想的PAM序列。因此，它限制了目标位点选择的灵活性，并使引物和CRISPR RNA（crRNA）的合理设计变得复杂[15]。为了克服与PAM要求相关的设计限制，开发了不依赖PAM的CRISPR检测策略。例如，Cao等人[16]通过不对称扩增生成了单链DNA（ssDNA），消除了对PAM序列的依赖。Yang等人[17]对PCR扩增产物进行T7外切酶处理，以实现不依赖PAM的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测。Ng等人[18]对RPA产物进行T7外切酶处理，从而无需PAM位点即可检测弧菌属菌株。采用这些方法时，必须处理双链DNA扩增产物，以暴露允许crRNA直接结合的区域，而不受PAM的限制[17]。T7外切酶是一种专针对双链DNA的酶，可逐步去除5′到3′方向的核苷酸，优先作用于线性或断裂的双链底物。这一酶促步骤创建了可访问的目标区域，从而促进了不依赖PAM的Cas12a激活。

尽管等温扩增具有优势，但新鲜农产品中的基质相关抑制剂（如多糖和酚类化合物）可能会干扰核酸扩增效率[19]。瓜类中含有这些干扰物，可能会降低检测效率[20]。在新鲜切开的瓜类中，污染水平通常较低，直接检测而不进行预先富集较为困难[21]。为了提高低污染新鲜切开瓜类样本的检测灵敏度，本研究采用了基于过滤的预浓缩步骤。该方法能够在提取核酸之前高效回收鼠伤寒沙门氏菌细胞，从而减少基质干扰并增加检测输入量，而无需依赖细菌培养。

虽然已有几项研究展示了使用T7外切酶的不依赖PAM的CRISPR/Cas12a系统，但这些研究应用于临床病原体或海洋食品基质（如牡蛎）[17]、[18]。然而，高糖分、多酚丰富的水果基质（如新鲜切开的瓜类）由于更强的扩增抑制剂而带来独特的分析挑战。据我们所知，这是首次将T7外切酶辅助的不依赖PAM的Cas12a检测方法专门应用于复杂新鲜农产品基质中的鼠伤寒沙门氏菌，其中植物来源化合物的干扰需要使用定制的预处理策略。

与之前需要双重crRNA或磷硫酰修饰引物来实现链偏好的不依赖PAM的CRISPR系统不同[17]、[18]，本研究表明，单个crRNA与未经修饰的RPA引物结合，在T7外切酶处理后足以激活Cas12a。这种简化提高了检测的稳健性，降低了成本和合成复杂性，并促进了其在常规食品安全工作流程中的广泛应用。

我们开发了一种不依赖PAM的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法来检测鼠伤寒沙门氏菌

细菌菌株和DNA提取

本研究中使用了鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 14028和六种非目标细菌菌株。非目标菌株包括金黄色葡萄球菌 ATCC 6538、大肠杆菌 ATCC 10536、单核细胞增生李斯特菌 ATCC 19117、蜡样芽孢杆菌 ATCC 10676、弗氏志贺菌 NCCP 10852和荧光假单胞菌 ATCC 13525。所有细菌菌株均保存在含50%甘油（v/v）的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB；Oxoid，Basingstoke，英国）中，置于-80°C下，并在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA；Oxoid）上于37°C培养

RPA引物筛选

为了检测鼠伤寒沙门氏菌，设计了四组针对invA的引物，invA包含特定于沙门氏菌属的序列。由于invA在沙门氏菌属中高度保守而在非沙门氏菌属中不存在，因此它是识别和区分沙门氏菌与其他微生物的高度特异性和可靠的分子标记[23]。所有四组引物均使用相当于10⁹ CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA进行了RPA检测（图1A）。所有组均扩增出了目标产物

结论

本研究开发了一种基于CRISPR/Cas12a的快速且不依赖PAM的检测系统，用于检测新鲜切开瓜类中的鼠伤寒沙门氏菌。与之前依赖双重crRNA或化学修饰引物的T7外切酶介导的不依赖PAM的方法不同，我们的方法使用单个正向crRNA和未经修饰的RPA引物，简化了检测设计并降低了成本。整个过程（包括预处理）大约在80分钟内完成，适用于现场食品安全检测

科学写作中生成式AI的声明

在准备这项工作时，作者使用了OpenAI/ChatGPT来提高可读性和语言表达。该工具仅用于语法检查和文本润色。使用OpenAI/ChatGPT后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容负全责。

CRediT作者贡献声明

So-Hyeon Ji：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学、调查、数据分析、概念化。Se-Wook Oh：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取。

资金来源

本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的支持，该基金会由韩国政府（MSIT）资助（项目编号：NRF-2021R1A2C1014181）。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。