基于双功能适配体识别策略的肝细胞癌循环肿瘤细胞的光电化学/电化学双重检测方法

《Microchemical Journal》：A dual-mode photoelectrochemical/electrochemical detection approach for circulating tumour cells in hepatocellular carcinoma based on a bifunctional aptamer recognition strategy

本研究开发基于MOF磁分离与双适配体策略的光电化学/电化学双模式系统，用于高效检测肝癌循环肿瘤细胞（CTC）。该系统通过TLS11a aptamer靶向CD44，Fe-MOF/C3N4探针识别EpCAM，实现CTC的特异性捕获与双重信号验证，检测限达10 cells/mL，线性范围50-1×10^5 cells/mL，双模校准有效降低假阳性，单平台操作提升便捷性，为液体活检和个性化治疗提供新工具。

　　

作者：薛毅 | 唐俊彦 | 李宗林 | 孙龙 | 王飞

单位：中国药科大学理学院化学系，江苏省南京市211198

摘要

循环肿瘤细胞（CTCs）在原发性肿瘤的进展和远处转移的形成中起着关键作用。这些标志物的精准检测对早期肿瘤诊断、治疗效果评估和机制研究具有重要意义。本研究提出了一种基于光电化学/电化学（PEC/EC）双模式系统的新型细胞检测方法，该方法结合了基于金属有机框架（MOFs）的磁分离技术和双适配体识别技术。在这种方法中，用TLS11a适配体修饰的Zr-MOF涂层磁珠能够高效捕获人肝细胞癌细胞（HepG2），同时这些细胞也被结合有Fe-MOF/C₃N₄（FeCN）的SYL3c适配体识别，后者靶向上皮细胞黏附分子（EpCAM）。该系统在含有抗坏血酸（AA）的电解质中表现出稳定的光电流和明确的峰值电流，检测限为10个细胞/mL（信噪比=3），线性范围覆盖50–1×10⁵个细胞/mL。双模信号之间的校准已被证明是减少假阳性结果和提高检测准确性的有效方法。此外，该方法能够在单一电化学平台上实现模式切换，从而无需依赖多种设备。其高灵敏度和特异性使得该方法成为肝细胞癌液体活检、个性化治疗和肿瘤转移机制研究中的有前景且可靠的工具。

引言

原发性肝细胞癌（HCC）是中国最常见的恶性肿瘤之一，其特征是发病率高、死亡率高等，在晚期阶段生存率极低[1]。大约70–80%的HCC患者在疾病已经局部晚期或转移时才被诊断出来，导致五年生存率低至12%[2]。因此，早期诊断HCC对于改善患者预后至关重要。目前肝癌的诊断方法主要包括影像技术、血清生物标志物检测和组织活检[3]。然而，影像技术对于小型或隐匿性病变的识别分辨率不足[4]。传统的血清生物标志物，如甲胎蛋白（AFP）和高尔基蛋白73（GP73），缺乏早期筛查所需的灵敏度和特异性[5]。虽然组织活检具有确定性，但它具有侵入性，不适合大规模临床应用[6]。因此，开发高灵敏度、低成本的方法对于非侵入性早期筛查和动态监测HCC进展至关重要。

近年来，由于液体活检具有最小侵入性、高灵敏度和动态评估潜力，已成为早期HCC诊断和监测的有前景的工具[7],[8]。循环肿瘤细胞（CTCs）作为体内活跃恶性肿瘤的直接证据，在预测转移风险、评估治疗反应和防止疾病复发方面具有重要的临床意义[9]。传统的生物传感器通常通过固定能够结合膜蛋白的识别单元来检测目标，检测信号来源于空间位阻效应[10]。因此，已经开发了多种传感技术，包括电化学（EC）[11]、光电化学（PEC）[12]、荧光[13]、比色免疫测定[14]、表面等离子体共振（SPR）[15]和表面增强拉曼散射（SERS）[16]。然而，依赖单一生物标志物的策略在复杂的生物流体中常常缺乏特异性[17]。此外，无标记传感器容易因非特异性相互作用而产生假阳性信号[18]。为了克服这些限制，多模态平台已成为CTC研究的热点[19],[20]。

电化学（EC）传感器通过界面氧化还原反应产生信号，具有操作简单、灵敏度高和易于微型化等优点[21],[22]。相比之下，光电化学（PEC）传感器利用光诱导的电子-空穴对，其行为受生物识别事件的影响。这种机制通过有效抑制背景信号而提供极高的灵敏度[23],[24]。在单一平台上集成可切换的PEC和EC模式可以在灵敏度和特异性之间达到最佳平衡[25]。这种协同作用同时提高了检测系统的准确性和稳健性。

我们开发了一种使用双适配体策略和HepG2细胞的双模式PEC/EC平台。如图1所示，用TLS11a修饰的Zr-MOF磁珠富集目标细胞，而用SYL3c修饰的Fe-MOF/C₃N₄（FeCN）靶向HepG2细胞上的上皮细胞黏附分子（EpCAM）以产生信号。该设置能够在低电位下产生明显的氧化峰，生成同步的PEC和EC信号。据我们所知，这是第一个结合基于MOFs的磁分离技术和双适配体识别的细胞平台。该系统能够在单一工作站上实现无缝模式切换，确保操作效率。此外，双信号交叉验证显著提高了检测的准确性和可靠性。

材料与试剂

六水合氯化铁、抗坏血酸（AA）、无水醋酸钠、戊二醛、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠购自新华化工试剂有限公司；对苯二甲酸（H?BDC）、2-氨基对苯二甲酸（NH?-H₂BDC）、氰化铁钾、亚铁氰化钾、牛血清白蛋白（BSA）、4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）、荧光异硫氰酸酯（FITC）和甲醛购自Aladdin Reagent

磁分离和信号输出探针的表征

图2C-E展示了磁珠及其相应Zr-MOF复合材料的SEM图像和EDS谱图。通过溶剂热法合成的Fe₃O₄纳米颗粒呈现出典型的球形形态和均匀的尺寸分布（图2C）。在MOF生长后，颗粒状的Zr-MOF晶体均匀地覆盖在Fe₃O₄表面，形成了明显的核壳结构（图2D）。图2E中的EDS元素映射显示了组成元素的均匀分布

结论

本研究开发了一种使用Fe₃O₄/Zr-MOF和Fe-MOF/C₃N₄复合材料的双模式识别策略，这些复合材料分别用TLS11a和SYL3c适配体修饰。该方法实现了HepG2细胞的有效磁分离和定量检测。传感系统利用Fe-MOF/C₃N₄探针的协同效应，增强了抗坏血酸的电催化氧化和C₃N₄的光电转换。

因此，该平台实现了信号放大的双模式电化学检测

CRediT作者贡献声明

薛毅：撰写初稿、进行研究、进行正式分析。 唐俊彦：撰写初稿、进行研究、进行正式分析。 李宗林：进行研究、进行正式分析。 孙龙：进行研究。 王飞：负责监督、项目管理和资金争取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。