一种基于CRISPR和石墨烯的场效应晶体管传感器，用于超灵敏地检测活的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

《Microchemical Journal》：A CRISPR-graphene field-effect transistor sensor for ultrasensitive detection of live methicillin-resistant Staphylococcus aureus

【字体：大中小】 时间：2026年03月13日 来源：Microchemical Journal 5.1

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　　本研究的创新性在于开发了一种基于EMA（Ethidium monoazide bromide）耦合的CRISPR Cas12a-GFET系统（ECGS），通过选择性标记死菌DNA实现活体MRSA的高灵敏度检测（0.5 aM），30分钟内完成，无需扩增步骤，显著降低假阳性，为食品和临床检测提供新工具。

王晓文|顾金龙|刘玉杰|庄千敏|田梦|陈磊

中国山东省济南市山东师范大学生命科学学院动物抗性生物学重点实验室

摘要

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）已成为全球公共卫生的威胁之一，它是医院内感染和社区获得性感染的重要病原体。因此，开发高灵敏度的检测方法对于有效预防MRSA感染至关重要。我们提出了一种创新的乙锭单氮化物溴化物（EMA）耦合CRISPR Cas12a-石墨烯场效应晶体管（GFET）系统（ECGS），用于快速、灵敏且特异性地检测活的MRSA。该方法基于EMA对死亡细菌DNA的选择性标记，从而能够识别活细菌。同时，CRISPR单碱基识别的高特异性和GFET的高灵敏度使得在30分钟内能够检测到低至0.5 aM的目标基因组。在本研究中，我们使用clfA基因来识别金黄色葡萄球菌（SA），并使用mecA基因来标记甲氧西林耐药性。ECGS平台为活病原体的检测建立了新的范式，对食品安全和公共卫生具有重要意义。

引言

金黄色葡萄球菌是一种全球普遍存在的病原体，自然存在于食物、水、空气和环境表面中，可引起皮肤和血液感染[5]。抗生素的出现有效解决了金黄色葡萄球菌的感染问题。然而，由于抗生素的广泛使用，金黄色葡萄球菌已经对多种抗生素产生了耐药性。特别是MRSA几乎对所有常见的抗菌药物都产生了耐药性，使其治疗变得复杂[4]。MRSA具有高度侵袭性和生物致病性，可导致血液感染、皮肤感染、人工关节感染、败血症和肺炎[1]、[21]、[35]、[40]。仅2019年，MRSA就导致了近10万例死亡，并且传播速度极快[42]。研究表明，甲氧西林耐药决定因子A（mecA）基因是导致SA耐药性的主要原因[3]、[15]。因此，迫切需要快速便捷的即时检测方法，而不局限于临床实验室，以监测MRSA并保障产品安全。

传统的检测方法，如基于微生物培养的检测方法，耗时且灵敏度和特异性有限[17]、[22]、[32]。近年来，分子检测技术在MRSA检测中显示出巨大潜力，包括核酸分子杂交、等温扩增和聚合酶链反应（PCR）。PCR检测是MRSA检测的“金标准”[24]、[27]、[29]。然而，由于热循环过程、反应设置的高复杂性以及耗时的扩增后凝胶电泳，其检测灵敏度较低[38]。大多数核酸检测方法涉及核酸扩增过程，这可能导致气溶胶污染。

CRISPR-Cas系统因其能够高灵敏度地识别单碱基差异并表现出高效的随机单链DNA切割活性，可应用于核酸检测[6]、[14]。GFET因其能够提供丰富的可分析信号、良好的导电性、高的载流子迁移率和快速响应时间以及较高的灵敏度，逐渐被用于病原体的快速核酸检测[18]、[23]、[25]。最近，CRISPR与GFET的结合越来越多地用于核酸检测[2]。CRISPR-GFET系统在特异性和灵敏度方面表现出优势，且整个过程中不会产生扩增和气溶胶污染。CRISPR-GFET被用于病毒核酸的检测[12]，如SARS-CoV-2[31]、ASFV的野生株和疫苗株[33]以及呼吸道合胞病毒[20]。孙等人将CRISPR与GFET结合用于乳腺癌中RMA和miRNA的检测[30]。王等人使用CRISPR-GFET实现了对结核分枝杆菌的快速灵敏检测[36]。然而，在检测细菌核酸时，无法确定这些核酸是否来自活细菌。因为死亡细菌的DNA可能在样本中长时间存在，虽然它没有感染或致病能力，但仍可能导致检测结果出现假阳性[39]。

核酸分子检测方法的一个局限性在于无法区分来自活细菌和死细菌的DNA。近年来，通过将光反应性DNA结合染料与核酸分子诊断技术结合，这一瓶颈得到了突破[7]。乙锭单氮化物溴化物（EMA）是一种具有光亲和标记特性的荧光核酸染料。EMA在光激活后选择性地穿透受损细胞并与DNA共价结合[16]。这种交联过程在提取过程中防止了DNA的完全释放，抑制了PCR扩增，并干扰了DNA-RNA杂交。利用这一机制，EMA耦合PCR（EMA-PCR）成为选择性检测活病原菌的可靠工具。Pilar等人使用EMA-qPCR检测环境水样中的活嗜肺军团菌 DNA[9]。Shota等人使用EMA-PCR检测活的结核分枝杆菌 DNA[10]，但它们的分析灵敏度和特异性有限，可能在复杂样本中影响诊断准确性。

在这里，我们提出了一种EMA耦合CRISPR Cas12a-GFET系统（ECGS），可以准确、灵敏且快速地识别活的MRSA。我们选择黏附素聚集因子（clfA）作为金黄色葡萄球菌的识别基因[13]、[26]，并选择mecA作为MRSA的特异性检测基因。ECGS能够在半小时内达到0.5 aM的最小检测限，且检测过程不需要扩增，显著降低了假阳性的可能性。

试剂

所有菌株均来自济南疾病控制中心的菌株保存库。获得的菌株包括MSSA、沙门氏菌、MRSA、铜绿假单胞菌、Warneri葡萄球菌和木糖葡萄球菌。有关试剂的详细信息，请参阅支持信息。核酸序列的详细信息见表S1。

crRNA的筛选

clfA和mecA基因序列来自NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

ECGS的设计

EMA是一种已知的光激活DNA交联剂，主要用于区分活细菌和死细菌[34]。目前，EMA主要与qPCR结合用于活细菌的识别[8]、[11]。CRISPR-GFET已逐渐应用于病毒和细菌的核酸检测。在这里，我们设想开发一种EMA耦合CRISPR Cas12a-GFET系统（ECGS）来特异性识别活的MRSA。

讨论与结论

MRSA是一种常见的病原体，通过污染鸡蛋、肉类、乳制品和其他环境样本引起严重的食物中毒。鉴于MRSA的快速传播和严重危害，选择一种方便、快速、灵敏且准确的检测方法对于食品安全检测更为有利[19]、[37]。然而，在食品加工过程中，死亡细菌的DNA可能会保持稳定很长时间。简单的分子检测方法可能会出现假阳性结果。

作者贡献声明

王晓文：撰写——原始草案、验证、软件、方法学、研究、数据分析、概念化。顾金龙：可视化、验证、软件、方法学、研究。刘玉杰：撰写——原始草案、验证、软件、方法学、研究、数据分析、概念化。庄千敏：撰写——原始草案、可视化、验证、软件。田梦：撰写——审稿与编辑、可视化。