脂质组学是一门先进的分析学科，致力于全面鉴定和量化脂质。目前已经鉴定出数千种不同的脂质物种，凸显了脂质结构的多样性及其相应的生化作用[1],[2],[3],[4],[5]。当前的靶向和非靶向脂质组学方法主要使用液相色谱（LC）结合质谱（MS）技术，对单个生物样本中的数百种脂质进行同时分析[6],[7],[8]。这一能力是通过整合多种色谱技术（包括反相色谱和亲水相互作用色谱（HILIC））与高灵敏度的质谱仪器实现的[9],[10],[11]。特别是非靶向脂质组学因其高通量特性而受到多个研究领域的青睐，这得益于MZmine[6]、MS-DIAL[12]等专门的脂质注释工具以及各种厂商特定平台[7]的支持。此外，在质谱系统中应用自动化碎片化技术（例如自动或迭代串联质谱（MS/MS））通过光谱数据库比较显著提高了众多脂质物种的结构鉴定效率和可靠性[7]。
尽管取得了进展，但在非靶向脂质组学中鉴定低丰度脂质仍然存在挑战，主要源于三个关键限制。首先，异构体之间的相似性是一个主要障碍，因为不同类别的脂质往往产生高度相似的碎片化模式，可能导致误鉴定和不准确[13],[14],[15]。其次，自动化系统中的前体选择偏差经常阻碍低信号强度脂质的检测[2]。由于质谱仪优先选择高丰度离子进行MS/MS碎片化，当低丰度脂质与主要离子在相同保留时间（RT）共洗脱时，其信号往往被忽略。最后，缺乏针对稀有脂质的数据库覆盖也是一个重大障碍。现有的脂质鉴定方法主要针对在生物样本中普遍存在且已在现有数据库中详细记录的脂质[16],[17]。尽管基于平台的计算机模拟库可能提示稀有脂质的存在[18]，但仅依靠质谱数据进行的结构分配往往具有不确定性[19]。因此，依赖MS/MS数据采集和现有平台的非靶向脂质组学策略在发现和准确鉴定低丰度脂质方面存在局限性，这强调了需要额外的化学信息来提高准确性。
基于LC-MS的色谱分离技术根据脂质的化学结构表现出可预测的保留模式，广泛用于改进脂质注释。在反相色谱中，分离过程由脂肪酸的酰链与非极性固定相之间的强相互作用驱动，从而根据碳链长度和不饱和度等结构特性实现清晰的分离[20],[21],[22]。特别是在同一类别的脂质中，RT基于碳链长度和不饱和键的数量表现出线性或二次回归关系[17],[23]。在HILIC中，分离主要受每种脂质独特头部基团的结合影响，而脂肪酸长度对保留的影响相对较弱[10]。这种受脂质结构属性控制的色谱模式被用来提高注释的准确性。这一理论原理已扩展到使用四维脂质组学的高通量脂质组分析中，其中包含了离子迁移率[24],[25]。
然而，这种对保留模式的理解主要是基于在哺乳动物来源中常见的主要脂质建立的，并广泛应用于已充分表征的脂质的高通量分析。这种方法的关键要求是用于构建保留模式的脂质必须具有高丰度，以便建立结构-RT关系的回归模型。因此，低丰度脂质常常被忽略，其存在经常被忽视。当生物样本来自不同物种时，这一限制尤为突出，因为不同物种之间的脂质存在显著差异。因此，针对哺乳动物样本中的主要脂质的质谱信息难以应用于其他物种中低丰度脂质的鉴定。
本文提出了一种跨物种比对脂质色谱模式的策略来鉴定低丰度脂质。使用一种常见的哺乳动物来源来确定已充分表征的脂质的色谱保留模式。随后，利用该模型根据脂质的结构和分子量预测其RT。这些定义的保留模式使得能够系统地预测次要脂质的色谱位置。通过使用已充分表征的主要脂质建立一致的保留模式，这种方法能够准确估计次要脂质的色谱行为。通过在预定RT进行靶向MS/MS分析，该策略减少了由于前体选择不明确而导致的鉴定错误。
应用跨物种比对策略分析了来自肠道微生物群的细胞外囊泡（EVs）中的脂质组，这是一种富含结构独特脂质的生物来源，在宿主-微生物相互作用中具有重要的生物学意义[26],[27]。随着越来越多的证据表明肠道微生物组对人类健康有深远影响，开发能够准确检测低丰度脂质的脂质组学方法的重要性日益凸显。微生物脂质组与哺乳动物脂质组在组成上存在差异，可能通过其独特的结构属性影响人体生理过程。例如，磷脂酰胆碱（PC）在真核细胞中占主导地位，而磷脂酰乙醇胺（PE）是微生物膜中的主要磷脂[28],[29]。此外，微生物脂质通常具有较低的饱和度[26],[30]。
微生物脂质组经常含有奇数链或支链脂质，这些脂质在哺乳动物体内很少从头合成，因此形成了结构独特的脂质物种。几种新鉴定的微生物脂质已被证实参与调节宿主免疫反应[26]。特别是，来自微生物群的EVs表现出独特的生物活性，这引发了关于这些功能是否与其独特的脂质组成有关的问题[31],[32]。这种兴趣促使越来越多的研究关注EVs的脂质谱型。尽管已经研究了多种微生物菌株的EVs，但现有的数据和参考数据库大多偏向于偶数链脂质，因为这些脂质更常见且被更好地表征[33],[34],[35],[36]。尽管对该领域的兴趣日益增加，但由于方法学上的限制，当前的脂质组学平台仍不足以全面鉴定稀有微生物来源的脂质物种。
鉴于准确检测低丰度脂质对于阐明微生物对人类健康的贡献的重要性，本研究特别设计了一种跨物种比对策略来预测微生物脂质在样本中的色谱位置。系统地比较了细胞、组织、血液和酵母等多种生物基质中的脂质谱型，以确定具有最高脂质多样性的基质作为RT校准集。利用比对后的保留模式，成功鉴定了低丰度的微生物脂质特征；在肠道微生物群样本中鉴定出了29种奇数链脂质。这种改进的方法提高了全面分析和理解结构独特微生物脂质及其在宿主生物化学中潜在作用的能力。
