双dCas13a/crRNA识别机制诱导的自启动LAMP技术，用于实现灵敏、可靠且基于颜色变化的胃癌相关环状RNA分析

《Microchemical Journal》：Dual dCas13a/crRNA recognition induced self-priming LAMP for sensitive, reliable, and colorimetric gastric cancer related circular RNA analysis

胃癌早期诊断的环RNA高特异性检测新方法：基于双dCas13a/crRNA识别和自引发LAMP显色技术

　　

Keli Zhong|Yuxiang Fu|Fang Li|Yang Li|Shunkai Ding|Xianming Liu|Yi Yang

摘要

环状RNA（circRNAs）由于其高稳定性和与疾病相关的表达特征，已成为胃癌诊断的潜在生物标志物。然而，由于它们与线性RNA异构体的序列相似性以及通常较低的丰度，准确检测仍然具有挑战性。在这项研究中，我们开发了一种新型比色检测方法，该方法结合了双dCas13a/crRNA识别技术和自启动环介导等温扩增（LAMP）技术，以实现高特异性和超灵敏度的circRNA分析。该方法使用两种可编程的dCas13a/crRNA复合物：一种固定在磁珠上，另一种与DNA激活链（s1）结合。这些复合物结合到目标circRNA的不同区域，利用独特的反向剪接接头确保高特异性。通过磁分离后，释放的s1链启动自启动的LAMP级联反应，在等温条件下实现高效的信号放大，从而赋予检测方法极高的灵敏度。随后通过基于SYBR Green的光催化比色反应对扩增产物进行定量。经过优化后，该检测方法的检测限达到12.3 fM，线性范围为50 fM至1 nM，并且能够有效区分线性RNA和错配序列。此外，该方法在复杂的生物样本中也能表现出良好的性能，并与传统PCR方法具有高度相关性。通过结合双dCas13a/crRNA的精确靶向能力和自启动LAMP的强大扩增能力，本研究建立了一个可靠、经济且无需仪器的circRNA检测平台，具有显著的早期癌症诊断潜力。

引言

胃癌仍然是全球主要的死亡原因之一[1]。尽管早期检测技术的进步和根治性手术的广泛应用提高了总体生存率，但许多患者仍然在晚期才被诊断出来，错过了最佳的治疗时机[2]，[3]。因此，识别可靠的生物标志物对于改善胃癌的早期诊断至关重要。环状RNA（circRNAs）是一类独特的内源性RNA，以其结构稳定性和特定的组织特异性表达特征而著称。circRNAs广泛存在于哺乳动物细胞中，通过与microRNAs或其他细胞分子相互作用在转录或转录后水平调节基因表达。越来越多的证据表明，circRNAs在胃癌的增殖和进展中起着重要作用[4]。例如，hsa_circ_002059在胃癌肿瘤组织中被报告下调，可能作为诊断标志物[5]。由于circRNAs在血浆中的相对较高丰度、强烈的特异性和显著的稳定性，它们成为新型生物标志物的有希望的候选者，可以为早期癌症检测、治疗和预后评估做出重要贡献。

circRNA检测的一个关键挑战是将其与线性RNA区分开来，因为它们除了circRNAs特有的反向剪接接头外，序列几乎完全相同[6]。此外，circRNAs的丰度通常较低，需要高度敏感和特异的方法进行准确定量。Northern blotting是一种传统技术，使用针对接头的探针通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离circRNAs和线性RNA[7]。然而，这种方法对于低丰度的circRNAs缺乏足够的灵敏度。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）也被用于circRNA检测，使用不同的或跨越接头的引物来特异性扩增circRNAs[8]，[9]。然而，引物设计在这个方法中至关重要；PCR热循环过程中的不准确引物结合可能导致假阳性信号，降低检测的可靠性。因此，迫切需要开发能够同时提高circRNA检测特异性和信号放大效率的创新策略。

CRISPR-Cas（规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白）系统已被广泛用于各种生物传感器的开发[10]，[11]，[12]，[13]，[14]，[15]，[16]，[17]，[18]。在该系统中，Cas13a作为一种RNA引导的RNA靶向效应器，在识别特定RNA目标后切割旁路单链RNA（ssRNA），因此在专门的RNA检测中具有巨大潜力[19]，[20]。从Cas13a衍生出的催化失活版本dCas13a保留了选择性结合与其CRISPR RNA（crRNA）引导序列互补的ssRNA目标的能力，但缺乏内切核糖核酸酶活性[21]。这种失活使得dCas13a能够作为可编程的模块化支架来招募功能性结构域。由于其高特异性和最小的脱靶效应，dCas13a已成为RNA识别和追踪的宝贵工具。虽然dCas13a/crRNA复合物提高了circRNA识别的特异性，但将其与等温信号放大策略结合对于实现足够的检测灵敏度至关重要。在当代等温扩增技术中，环介导等温扩增（LAMP）已被有效用于circRNA的高灵敏度定量[22]，[23]。LAMP是一种稳健的分子方法，能够在恒定温度下快速、准确且高灵敏度地检测核酸，无需复杂的温度循环设备[24]，[25]。其简单性、快速性和稳健性使其特别适用于即时诊断、现场检测和资源有限的场景。

利用dCas13a/crRNA复合物的高特异性和LAMP提供的强信号放大能力[26]，我们开发了一种敏感可靠的circRNA检测比色方法。该方法使用两种dCas13a/crRNA复合物（dCas13a/crRNA-1@MBs和s1/dCas13a/crRNA-2），它们被设计为特异性结合目标circRNA。经过磁富集和去除未结合的成分后，s1/dCas13a/crRNA-2中的s1链展开一个发夹探针，启动自启动的LAMP扩增，生成大量的双链DNA（dsDNA）产物。值得注意的是，SYBR Green I（SG）与dsDNA产物结合，引起可见的颜色变化。生成的dsDNA/SG复合物具有光催化活性，在光照下能够利用溶解的氧气氧化显色底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）。与具有类似催化功能的G-四链体DNA酶不同，这种光催化行为具有高度通用性，因为几乎任何dsDNA序列都能引发这种反应。因此，我们的双dCas13a/crRNA识别耦合扩增检测方法能够实现精确和灵敏的circRNA检测，证明了其作为准确circRNA分析工具的实用性。

材料与设备

本研究中使用的所有寡核苷酸，包括用于dsDNA/SG基比色检测的寡核苷酸，均来自上海Sango有限公司（中国北京）。它们的详细序列见表S1。3,3′,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）和SYBR Green购自Sigma-Aldrich（中国北京）。血红素（2 mM）的储备溶液在二甲基亚砜（DMSO）中制备。用于显色步骤的过氧化氢（H?O?）来自上海Sango有限公司。

双dCas13a/crRNA识别诱导的自启动LAMP检测circRNA的比色原理

图1概述了用于circRNA比色检测的双dCas13a/crRNA识别诱导的自启动LAMP检测原理。该检测过程包括四个关键阶段：双dCas13a/crRNA复合物对目标circRNA的特异性识别、自启动的LAMP扩增、单链DNA激活剂（s1）的循环利用以及基于dsDNA/SG的显色反应。在此设计中，使用了两种不同的dCas13a/crRNA复合物，dCas13a/crRNA-1和

结论

总之，我们成功开发了一种双dCas13a/crRNA识别诱导的自启动LAMP系统，用于敏感、可靠且基于比色的胃癌相关circRNA检测。该方法利用dCas13a/crRNA复合物，其功能类似于传统免疫检测中的抗体，能够实现特定目标circRNA的识别。由于dCas13a/crRNA复合物提供的双重目标识别能力，该方法表现出更高的

CRediT作者贡献声明

Keli Zhong：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，验证，监督，项目管理，研究，概念化。Yuxiang Fu：验证，研究，正式分析。Fang Li：资源提供，正式分析。Yang Li：研究，正式分析，数据管理。Shunkai Ding：验证，正式分析，数据管理。Xianming Liu：验证，软件，数据管理。Yi Yang：撰写 – 审稿与编辑，可视化，验证，数据管理，

资金信息

本研究由广东省深圳市人民医院普通外科重点学科资助（编号：JCYJ20160422143333572）。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

不适用。