利用表面增强拉曼光谱技术同时检测尿液中的高浓度尿酸和低浓度胆红素

《Microchemical Journal》：Joint detection of high-level uric acid and low-level bilirubin in urine by surface-enhanced Raman spectroscopy

本研究开发了一种基于Fe3O4@GO@Ag纳米复合材料的表面增强拉曼光谱（SERS）策略，通过pH微调和合理稀释抑制基质干扰及高浓度尿酸对胆红素的信号抑制，首次实现尿液中胆红素（0.28 μM）与尿酸（158 μM）的同步定量检测，回收率96.5–103.2%，相对标准偏差3.7–5.3%，为复杂生物样本多组分分析提供新方法。

　　

朱青霞|李新航|李浩|赵云丽|卢峰

摘要

在尿液分析中，基质干扰以及分析物之间的信号相互抑制，尤其是对于浓度差异较大的生物标志物，对同时、灵敏且快速地检测构成了重大挑战。为了解决这个问题，我们开发了一种基于多功能Fe₃O₄@GO@Ag纳米复合材料的新型表面增强拉曼光谱（SERS）策略，该策略结合了富集、选择性吸附和SERS增强作用。这种方法的一个关键创新是引入了pH值精细调节机制，可以有选择地调节胆红素（BR）的吸附和信号响应，有效减弱了高浓度尿酸（UA）对信号的主导作用。结合合理的稀释方案，该方法首次实现了尿液中BR和UA的同时定量分析，尽管它们的浓度相差约100倍。该方法对BR的检测限为0.28 μM，对UA的检测限为158 μM，满足了临床需求。在正常人尿液中的验证结果显示，BR的回收率为96.5–103.2%，UA的回收率为96.7–103.2%，相对标准偏差分别为4.3–5.2%和3.7–5.3%，证实了其准确性和可靠性。这项工作建立了一个稳健且创新的基于SERS的多组分尿液分析平台，适用于具有挑战性的浓度条件。

引言

随着医疗技术的进步和对健康管理的重视增加，及时准确地检测生物标志物变得尤为重要。生物标志物不仅在疾病预防、诊断和监测中发挥着重要作用，还用于评估新药物和诊断方法的有效性和安全性[1]。尿液作为临床分析的理想生物样本受到青睐，因为它富含生物信息，易于收集且无创[2]。然而，尿液中的尿素、蛋白质和磷酸盐等基质可能会干扰生物标志物（如BR、UA）的检测，从而影响测量结果的准确性和可靠性，这对尿液分析来说是一个挑战。BR作为一种重要的生物标志物，对于评估患有黄疸、肝炎、精神障碍、脑瘫和脑损伤等健康问题的患者至关重要[3]；而UA是嘌呤代谢的产物，可用作肾病的诊断标志物[4][5]。这两种成分也是反映健康人群健康状况的重要标志物[6][7]。在大多数病理生理条件下，UA的浓度是BR的10²到10³倍[8][9]，高浓度成分对低浓度成分的竞争或掩盖效应也使得同时准确检测BR和UA变得困难。因此，迫切需要开发一种能够快速同时检测高浓度UA和低浓度BR的方法。这种方法对于多种疾病的早期检测、准确诊断、预后治疗以及健康人群的健康状况管理具有重要意义。

常用的尿液生物标志物检测方法包括高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）、气相色谱-质谱（GC/MS）、荧光光谱和电化学方法。尽管这些方法具有能够准确检测各种生物标志物的特点，但每种方法都存在实际限制。例如，色谱法在分离方面表现出色，但需要复杂的预处理和昂贵的操作成本；电化学方法虽然灵敏度高，但容易受到干扰且需要昂贵的材料；荧光光谱虽然选择性很强，但主要局限于荧光目标物和特定样品体积。近年来，表面增强拉曼光谱（SERS）作为一种有前景的替代方案出现，具有样品需求少、独特的分子指纹识别能力、超高灵敏度和快速分析等优点[10][11]。这些特性使得SERS特别适合生物样本的检测。这种潜力正在下一代柔性光学生物传感器平台中得到积极实现，例如WaveFlex生物传感器[12][13]，它们将功能性纳米材料与光学波导集成在一起，应用于可穿戴设备和即时检测设备，如SERS微针[14]、等离子体水凝胶[15]和基于纸张的微流控系统[16]，用于连续生物流体分析。这些进展共同凸显了SERS技术的多功能性和应用范围的扩展。值得注意的是，SERS技术已被积极用于检测关键生物标志物，如BR和UA。对于BR的分析，Kartashova等人[17]使用金纳米粒子对硅纳米棒进行功能化处理，实现了在尿液中具有临床相关灵敏度的检测；Li等人[18]开发了掺铁的二硫化钼纳米花（Fe-MoS₂NFs）作为血清样本的选择性SERS基底；对于UA的检测，Alula等人[19]使用Ag/ZnO/Fe?O?纳米复合材料在尿液中实现了快速传感；Zhao等人[4]采用多层Au/Ag基底结合电化学SERS（EC-SERS）进行了子痫前期的UA定量分析。

尽管在检测单个生物标志物（如BR或UA）方面取得了显著进展，但在尿液中同时检测多种分析物仍然是一个艰巨的挑战，尤其是在它们以巨大浓度差异共存时。原因可能是UA作为嘌呤代谢的最终产物在体内含量丰富，当样本中同时存在其他多种成分时，UA的SERS信号会占据主导地位[20][21][22]，这导致其他分析物的信号被UA信号掩盖或抑制，难以准确检测。例如，Iris等人[23]使用SERS检测尿液中的抗坏血酸、多巴胺和UA时，发现只有UA的信号被SERS或EC-SERS成功捕获，而抗坏血酸和多巴胺的信号相对较弱或被掩盖。UA的这种主导效应表明，传统的SERS策略在处理复杂生物流体时存在根本性局限：它们缺乏内在机制来管理浓度差异极大的分析物之间的竞争性吸附和信号干扰。因此，迄今为止，尚未通过SERS实现尿液中高浓度UA和低浓度BR的准确定量共检测。因此，迫切需要开发一种新的SERS检测方法，既能避免或抑制尿液基质的干扰，又能实现高浓度UA和低浓度BR的定量检测。同时，还需要确保该方法具有灵敏度高、选择性强、操作简单和快速的特点。

为了解决这些问题，本研究制备了分散良好的Fe₃O₄@GO@Ag纳米复合材料作为基底，具有同时富集、选择性吸附和SERS增强的三重功能，其在结构和功能上优于单一功能的AgNPs以及双功能Fe₃O₄@Ag或GO@Ag基底。通过使用尿液稀释和pH值精细调节策略，可以很好地抑制尿液基质的干扰以及UA对BR检测的主导效应，从而首次实现了尿液样本中两种浓度差异显著生物标志物的联合检测。在此基础上，设计了一个完整的检测流程，考虑了尿液检测中可能出现的各种干扰和浓度差异。该方法为多种疾病的综合诊断或异常生理状态的检测提供了重要的BR-UA浓度信息，为具有显著浓度差异的生物样本的多组分分析提供了一种可靠高效的技术。

材料与试剂

氧化石墨烯（GO，99.5%）、硝酸银（AgNO₃，99.8%）、柠檬酸钠（C₆H₅Na₃O₇）、4-巯基吡啶（4-MPy，97%）、甲醇（CH₃OH，99.5%）、氢氧化钠（NaOH，97%）、浓盐酸（HCl，36.0–38.0%）、胆红素（C₃₃H₃₆N₄O₆，BR）和尿酸（C₅H₄N₄O₃，UA）均购自Titan Scientific（中国上海）；人工尿液购自Phygene（中国福州）；磁性微球（Fe₃O₄@NH₂）购自Langfei Biotechnology（中国河北）。去离子水

Fe₃O₄@GO@Ag纳米复合材料的表征

由于Fe₃O₄微球表面具有氨基官能团，而GO表面具有羧基官能团，因此GO的单层可以通过静电相互作用组装在Fe₃O₄微球上。然后通过原位还原生长方法在GO上制备Ag纳米粒子，进而制备了Fe₃O₄@GO@Ag纳米复合材料，其表征结果如图S1所示。

Fe₃O₄@GO@Ag纳米复合材料的SERS性能

首先使用4-MPy作为探针评估了Fe₃O₄@GO@Ag纳米复合材料的SERS活性

结论

本研究结合了磁性纳米复合材料、pH值精细调节、尿液稀释和SERS检测技术，解决了在同一SERS基底上同时定量检测浓度差异较大的BR和UA成分的问题，并首次实现了尿液中BR和UA生物标志物的联合检测。充分考虑了BR和UA检测过程中可能遇到的各种情况，提供了直观明了的

CRediT作者贡献声明

朱青霞：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿。李新航：方法学设计，数据分析。李浩：软件开发，数据分析。赵云丽：撰写 – 审稿与编辑，资源协调。卢峰：撰写 – 审稿与编辑，资源协调，资金争取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：82273894）和上海科创计划（编号：23YF1422600）的支持。