基于AuPt双金属信号增强剂的赭曲霉毒素A的Exonuclease III扩增电化学检测方法

《Microchemical Journal》：Exonuclease III-amplified electrochemical detection of ochratoxin A based on AuPt bimetallic signal enhancer

电化学 biosensor 通过 Exo III 核酸循环扩增与 AuPt@Thi 纳米颗粒信号增强协同作用，实现 OTA 高灵敏度检测（检测限 0.07 pg/mL，范围 0.1–100 ng/mL），并成功应用于复杂食品基质的实际检测。

　　

河南王|白昂陈|赵旭然|黄月

中国南京林业大学森林食品资源开发与利用国家重点实验室，南京210037

摘要

赭曲霉毒素A（OTA）作为最危险的霉菌毒素之一，因其广泛存在于食品中并对人类健康构成严重威胁而备受关注。本文开发了一种基于外切核酸酶III（Exo III）的电化学生物传感器，利用双金属AuPt作为信号增强剂来灵敏检测OTA。负载有大量电化学物质硫辛酸的金铂（AuPt）纳米颗粒（AuPt@Thi）被用作优异的信号放大探针。OTA的特异性识别会触发DNA探针的构象变化，并诱导Exo III辅助的核酸循环放大，生成大量的DNA片段，这些片段随后被引入传感界面，使信号探针AuPt@Thi能够附着上去。具有出色电导率、优异负载能力和高催化活性的双金属AuPt能够增强硫辛酸的氧化还原信号，从而显著提高信号响应强度。得益于Exo III催化的循环放大和电化学活性AuPt@Thi的信号增强作用，该生物传感器在OTA检测方面表现出优异的分析性能，具有响应快速、稳定性好、成本效益高和操作简便等优点。在最佳条件下，检测范围为0.1 pg mL^?1–100 ng mL^?1，检测限可低至0.07 pg mL^?1。此外，制备的电化学生物传感器具有良好的特异性、可接受的稳定性和重复性，能够可靠地监测实际食品样本中的OTA，显示出在食品安全检测领域的应用前景。

引言

赭曲霉毒素A（OTA）是全球最危险的霉菌毒素之一，广泛存在于各种农产品和植物性食品中[1]、[2]。已知OTA具有稳定的化学性质、耐高温性和长半衰期，这使得从食物链中清除OTA变得困难，从而对人类健康构成严重风险[3]。大量研究表明，OTA暴露与肝脏和肾脏毒性、免疫毒性、致畸性和致癌性等不良后果有关[4]、[5]。鉴于其普遍存在和有害影响，监管机构已制定了严格的OTA允许含量标准。因此，准确灵敏地检测OTA对于满足食品安全需求至关重要。传统的OTA检测方法主要包括薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、气相色谱/质谱（GC/MS）和酶联免疫吸附测定（ELISA）[6]、[7]。基于色谱或质谱的仪器分析技术具有高分辨率和重复性，但需要昂贵且不便于携带的仪器、繁琐的样品制备过程和耗时的操作步骤。而依赖抗体的ELISA在复杂基质中的痕量分析可能存在交叉反应或稳定性不足的问题。近年来，具有快速响应、操作简便、成本低廉和易于微型化特点的电化学生物传感器在霉菌毒素检测领域受到了广泛关注[8]、[9]。尽管有这些优势，但现有的OTA检测生物传感器通常需要复杂的修饰或标记，且由于信噪比低或缺乏有效的信号放大机制，灵敏度可能受到限制。因此，建立一种简单快速的OTA检测方法仍然十分必要。

具有独特性质和特定功能的纳米结构常被引入电化学生物传感器中，以促进信号转导和放大[10]、[11]、[12]、[13]。在不同的纳米结构中，金属纳米颗粒因具有较大的比表面积、良好的生物相容性和导电性、易于合成和修饰等优点而在生物传感中发挥着重要作用[14]、[15]。然而，单金属纳米颗粒可能存在成本高、稳定性不足和负载能力有限的缺点。与单金属纳米颗粒相比，双金属纳米颗粒由于两种不同金属之间的协同效应，表现出更优的电学性质、优化的物理结构以及增强的化学活性，同时减少了化学和物理操作所需的资源和底物[16]。朱等人[17]合成了Fe-Cu双金属有机框架，作为一种新型微波敏化剂，具有显著的加热性能和优异的纳米酶活性，可用于结合微波热疗和化学动力学疗法实现肿瘤的诊断和治疗。杨的研究团队利用ZIF-67衍生的NiCo-LDH纳米笼作为高效的氧化酶模拟物，开发了一种便携式可视化生物传感平台，用于检测β-半乳糖苷酶活性和大肠杆菌[18]。随后，该团队开发了一种光电化学适配体传感器，利用新型双Z结构的ZnS/Bi₂S₃/Bi₂Ti₄O₁₁电纺纳米异质结作为高活性光阴极材料，实现了0.385 pg mL^{?1的检测限[19]。由Au和Pt组成的AuPt纳米颗粒（AuPt NPs）因其可工程化的表面、众多的活性位点和高表面积与体积比，为负载各种活性分子和固定功能性生物元件提供了理想平台[20]、[21]。此外，双金属化带来的几何和电子效应的协同作用赋予了AuPt NPs优异的电导率，大大加快了电子转移速度并缩短了响应时间[22]。双金属AuPt NPs还比单金属纳米颗粒具有更好的化学稳定性和催化活性，以及更低的贵金属使用量[23]，从而提高了电化学生物传感器的整体分析性能。}

为了提高痕量检测的灵敏度，提出了多种核酸放大策略[24]。由于酶具有高催化活性、高特异性、优异效率和操作简便等优点，酶辅助的核酸放大策略受到了广泛关注[25]、[26]。通过酶促循环放大，少量的目标物质可以转化为大量的类似物质，从而实现指数级的核酸放大。此外，酶辅助的循环放大易于与其他放大策略结合，为更精确和灵敏的检测提供了有力支持[27]。外切核酸酶III（Exo III）作为一种核酸酶，能够特异性催化双链DNA钝端或凹陷3′端的逐步水解[28]，产生可用于循环放大的单链DNA片段。由于其出色的催化效率和稳定性、较少的干扰反应、不需要特定的识别序列和复杂的温度控制程序[29]，Exo III非常适合用于建立酶辅助的核酸放大策略。值得注意的是，Exo III对环境的敏感性低且兼容性好，可以与其纳米结构传感元件集成而不影响其活性[30]，这为开发具有优异分析性能和简单部署的新型电化学生物传感器提供了有力途径，通过结合Exo III辅助的循环放大和功能化的双金属纳米颗粒来实现霉菌毒素的检测。

本文构建了一种高性能的OTA检测生物传感器，将AuPt双金属信号增强剂集成到Exo III辅助的电化学平台上。制备了负载有大量电化学物质硫辛酸（Thi）的高导电性和催化性AuPt纳米颗粒（AuPt@Thi）作为信号放大探针，这些探针能够有效加速电子转移并增强硫辛酸的氧化还原信号。目标OTA的存在会触发DNA探针的构象变化，并启动Exo III辅助的核酸循环放大，生成大量DNA片段，使信号探针AuPt@Thi附着在电极表面，从而显著提高信号响应强度。利用Exo III高效酶促循环和电化学活性AuPt@Thi信号增强剂的协同放大作用，所开发的电化学生物传感器在OTA检测方面表现出优异的性能。此外，该生物传感器具有高特异性、良好的稳定性、快速响应以及操作便利性，并已在实际食品样本中进行了测试，为在复杂环境中准确检测OTA提供了有前景的平台，同时也具有在食品安全监测中的实际应用潜力。

材料与试剂

赭曲霉毒素A（OTA）购自MedChemExpress（美国新泽西州蒙茅斯 Junction）。外切核酸酶III（Exo III）从Takara Biotechnology Co., Ltd.（中国大连）订购。Tris-(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride（TCEP）、mercaptohexanol（MCH）、magnesium chloride（MgCl₂）、trihydroxymethyl aminomethane（Tris）和无水柠檬酸钠从J&K Scientific Co., Ltd.（中国北京）购买。Chloroauric acid（HAuCl₄·3H₂O）、potassium tetrachloroplatinate（K₂PtCl₄）和sodium chloride也来自同一公司。

检测原理

图1展示了使用AuPt双金属信号增强剂进行Exo III辅助电化学检测OTA的原理。首先制备AuNPs，然后在原位生长PtNPs，以获得具有更大活性表面积、更高催化活性和更好电导率的AuPt NPs，随后用DNA探针1（P1）进行修饰，并负载大量信号分子硫辛酸（Thi），形成AuPt@Thi/P1纳米复合材料作为信号放大标签。

结论

总结来说，通过将Exo III辅助的核酸循环放大与AuPt双金属信号增强剂相结合，成功开发了一种创新的电化学生物传感器用于OTA检测。Exo III催化的核酸循环实现了强大的信号放大，确保了检测效果，而高导电性和催化性的AuPt纳米颗粒负载有大量的硫辛酸，提供了更灵敏的信号传导方式，从而实现了OTA的高性能检测。

CRediT作者贡献声明

河南王：撰写——原始草案、验证、研究、数据管理。白昂陈：验证、研究。赵旭然：验证、形式分析。黄月：撰写——审稿与编辑、监督、资源协调、方法学设计、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：31901771）的支持。