《The FASEB Journal》：Glycosomal Phosphoenolpyruvate Carboxykinase CRISPR/Cas9-Deletion and Its Role in Trypanosoma cruzi Metacyclogenesis and Infectivity in Mammalian Host
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本研究通过CRISPR/Cas9技术首次成功构建了克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）糖酵体磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（PEPCK）单等位基因敲除株（TcPEPCK-sKO），系统揭示了该酶在连接糖酵解与线粒体生物能学、调控寄生虫在媒介昆虫体内分化（metacyclogenesis）及感染哺乳动物宿主过程中的关键作用。研究发现，PEPCK功能受损改变了寄生虫的能量代谢模式，进而影响了其感染与致病进程，为理解锥虫生物学及开发新治疗靶点提供了重要见解。
糖酵体PEPCK基因敲除株的构建与验证
研究团队利用CRISPR/Cas9技术，以金黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）和特异性sgRNA组成的核糖核蛋白复合物，对克氏锥虫巴西A4株表鞭毛体（epimastigote）的PEPCK编码基因（TcBrA4_0071790和TcBrA4_0071840）进行编辑。通过同源重组，成功将含有三个框内终止密码子和M13噬菌体序列的修复模板整合到基因组中，获得了仅有一个等位基因被敲除的单克隆寄生虫，即TcPEPCK-sKO株。验证实验表明，与未敲除的对照株（tdTomato）相比，TcPEPCK-sKO寄生虫的PEPCK基因表达量下降了40%，其将磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化为草酰乙酸（OAA）的酶活性也相应降低了49%。
PEPCK缺陷对表鞭毛体能量代谢的影响
在富含葡萄糖（10 mM）的环境中，PEPCK的部分缺失显著影响了寄生虫的能量代谢。TcPEPCK-sKO表鞭毛体的葡萄糖消耗量减少了36%。线粒体呼吸测量显示，其常规耗氧率（Routine OCR）、与氧化磷酸化（OXPHOS）相关的耗氧率以及电子传递系统（ETS）的最大耗氧能力均显著下降，表明线粒体呼吸，特别是氧化磷酸化过程受到抑制。有趣的是，在葡萄糖存在时，TcPEPCK-sKO寄生虫的ATP产量对线粒体ATP合酶抑制剂寡霉素（oligomycin）的依赖性降低，提示其ATP生产对线粒体的依赖度下降。相反，在低葡萄糖（~0.6 mM）条件下，PEPCK的活性对于线粒体生物能学、ATP生产或寄生虫增殖并非关键。
为补偿PEPCK介导的琥珀酸发酵途径（主要糖酵体NAD+再生途径）的功能受损，寄生虫上调了另一条竞争性代谢途径。定量PCR结果显示，丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）的表达上调了2倍。PPDK能将PEP转化为丙酮酸并生成ATP，随后丙酮酸经丙氨酸脱氢酶作用还原为丙氨酸，同时再生一个NAD+。与这一代谢重编程一致，TcPEPCK-sKO寄生虫的细胞内丙氨酸池增加了60%，但分泌到培养上清中的丙氨酸却减少了35%，表明产生的丙氨酸可能更多地被寄生虫自身留存利用。
PEPCK在寄生虫分化与感染过程中的双重角色
尽管PEPCK缺陷对表鞭毛体增殖的影响相对温和（在高糖培养基中仅部分减少），但它对寄生虫的生命周期转换和感染能力产生了深远且看似矛盾的影响。
一方面，PEPCK是寄生虫在媒介昆虫体内完成分化（即循环后期转化，metacyclogenesis）所必需的。在体外诱导实验中，TcPEPCK-sKO表鞭毛体分化为感染性循环后期锥鞭毛体（metacyclic trypomastigote）的效率降低了56%。
另一方面，一旦寄生虫成功进入哺乳动物宿主细胞，PEPCK缺陷却显示出增强感染的能力。细胞感染实验表明，TcPEPCK-sKO来源的锥鞭毛体对Vero细胞的入侵能力下降了43%。然而，一旦成功侵入，转化为无鞭毛体（amastigote）后，其复制速度显著加快。在感染后第3天和第4天，每个宿主细胞内的TcPEPCK-sKO无鞭毛体数量分别增加了19%和43%。这导致子代锥鞭毛体更早、更大量地释放，在感染后第6天，上清中的锥鞭毛体数量是对照组的8倍。
体内感染模型验证代谢变化对致病性的影响
为了评估代谢改变在整体感染中的作用，研究在免疫缺陷（IFNγ-KO）和免疫健全（野生型C57BL/6）小鼠模型中进行了感染实验。
在IFNγ-KO小鼠中，感染TcPEPCK-sKO寄生虫引发了不受控制的寄生虫血症。在感染后第7、10和15天，血液中的锥鞭毛体数量分别是对照组的8.9倍、13.6倍和8.6倍，并导致小鼠出现严重病理状况。然而，通过组织透明化成像和qPCR检测发现，尽管血液中寄生虫负荷极高，但其在心、骨骼肌和肠道等组织中的寄生虫集落（nest）数量和寄生虫载量却低于感染对照株的小鼠。这可能提示感染进程加速，组织感染峰值提前出现。
在免疫健全的野生型小鼠中，免疫系统有效控制了两种寄生虫的感染。感染早期（第5、7天）可检测到低水平的寄生虫血症，且两者无显著差异，至第10天已无法在血中检出寄生虫。感染后第21天，各组织中的寄生虫载量也无显著差异，表明健全的免疫系统能够遏制TcPEPCK-sKO增强的感染潜力。
结论与意义
本研究首次在克氏锥虫中实现了糖酵体PEPCK基因的部分敲除，并系统阐明了其在寄生虫能量代谢和感染生物学中的核心作用。PEPCK作为连接糖酵体发酵与线粒体能量代谢的关键节点，其功能缺失导致寄生虫在高糖环境下发生代谢重编程，减少葡萄糖利用和线粒体呼吸，同时上调PPDK-丙氨酸途径以维持糖酵体氧化还原平衡。这种代谢适应足以支持表鞭毛体的基本增殖，但却严重损害了其向感染性锥鞭毛体的分化能力，揭示了PEPCK在寄生虫生命周期转换中的必要性。
更具启发性的是，PEPCK缺陷虽然削弱了寄生虫对宿主细胞的初始入侵，却意外地增强了其在宿主细胞内的复制能力，导致在免疫缺陷宿主中爆发性、致死性的感染。这表明，靶向PEPCK等代谢酶的治疗策略可能需要谨慎评估，因为扰动寄生虫代谢有时可能产生增强其致病性的非预期后果。该研究不仅深化了对克氏锥虫代谢可塑性与致病机制的理解，也为基于代谢的抗寄生虫药物研发提供了新的重要视角和复杂案例。
