《The FASEB Journal》：Single Cell Analysis Reveals the Presence of Novel Intermediate Cells in Both Mice and Patients With Severe MASLD
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本研究通过结合单细胞RNA测序（sc-RNAseq）与空间蛋白质组学技术，系统性揭示了代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）向代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）及纤维化进展过程中，肝细胞（HEPs）、内皮细胞（ENDOs）、肝星状细胞（HSCs）、Kupffer细胞（KCs）等细胞群体的异质性演化，并首次鉴定出HSCs/ENDOs、HEPs/ENDOs、KCs/ENDOs、HEPs/KCs等5类新型中间细胞群，为理解MASLD的细胞机制提供了全新视角。
引言：MASLD的全球挑战与细胞异质性之谜
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是全球最常见的慢性肝病，影响着约25%的成年人口。其疾病谱涵盖从单纯性脂肪肝（SLD）到代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH），并可进一步发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌（HCC）。MASLD的发病机制涉及肝脏内多种细胞类型的复杂变化，然而，驱动疾病从单纯脂肪变性向MASH及纤维化转变的精细调控机制，尤其是疾病进程中细胞群体的异质性、特异性的转录组特征及其相互作用网络，仍未完全阐明。传统的大体积RNA测序难以解析不同细胞亚型在炎症和纤维化发生中的驱动作用及其空间分布模式。因此，本研究旨在单细胞分辨率下，利用AMLN饮食诱导的小鼠MASLD模型，结合sc-RNAseq和空间蛋白质组学技术，深入探究疾病进展中的细胞异质性和新型细胞群体。
结果
1. 单细胞转录组图谱揭示32个细胞集群
研究人员对喂食标准饮食（SD）或AMLN饮食14、22、28周的小鼠肝脏进行了肝细胞（HEPs）和非实质细胞（NPCs）的分选与sc-RNAseq分析，共获得约30,000个单细胞转录组。通过整合分析与聚类，共鉴定出32个细胞集群（Cls 0-31），并依据经典标记基因将其注释为肝细胞（HEPs，15个集群）、胆管细胞（CHOLs，1个）、肝星状细胞（HSCs，2个）、内皮细胞（ENDOs，5个）、Kupffer细胞/单核巨噬细胞（KCs/MoMf，5个）、中性粒细胞（N，1个）、树突状细胞（DCs，1个）、T细胞/NK细胞（1个）和B细胞（1个）。值得注意的是，部分集群（如Cls 10, 15, 17, 21, 26）同时表达两种不同细胞类型的标志物，提示了中间细胞表型的存在。
2. 肝细胞（HEPs）的异质性演变与分区紊乱
HEPs是最大的细胞群体，其15个集群的组成随疾病严重程度发生动态变化。在对照组，Cls 2、3、6、9占主导。在脂肪变性阶段，与脂质代谢、胆汁分泌相关的Cls 4、11、12、14、18、19增多。在MASH阶段，Cls 4和12进一步增加，并出现了Cls 7、28、30等特异性集群，同时脂质代谢、三羧酸循环和氧化磷酸化通路下调。在MASH-纤维化阶段，Cls 12、18、28、30几乎消失，而Cls 4和7持续存在，提示部分肝细胞可能发生去分化或损伤死亡。
对肝细胞分区（zonation）标记的分析显示，正常肝脏和脂肪变性肝细胞呈现生理性的汇管区（periportal, PP）和中心静脉周（pericentral, PC）分布。然而，在MASH和MASH-纤维化阶段，具有汇管区定位的肝细胞集群显著增加，反映了该区域在晚期肝损伤中的重要性，也表明疾病导致了肝脏分区的紊乱。
3. 内皮细胞（ENDOs）在纤维化中的核心作用及其表型转化
ENDOs是NPCs中最大的群体，其5个集群（Cls 0, 1, 15, 16, 22）在疾病进展中发生显著变化。Cls 1主要在对照组，代表经典的肝窦内皮细胞（LSECs）。Cls 16在脂肪变性期出现并持续至后期，高表达血管生成相关基因（如Notch1、Dll4）。MASH-纤维化阶段，LSEC集群Cls 0细胞数量激增，并高表达血管内皮生长因子受体（Kdr, Flt1）、转化生长因子-β受体（Tgfβr3）、细胞因子及其受体、整合素及细胞骨架重塑相关基因，凸显其在纤维生成中的核心角色。
特别值得注意的是Cls 22，其在MASH-纤维化阶段略有增加，表现出内皮-间质转化（EndMT）的特征：逐渐丢失内皮标志物PECAM1/CD31，同时获得间质细胞特异性基因（如fibulin2/5、BMP4）和细胞外基质（ECM）分子。这种表型转化可能是严重肝损伤中肝窦毛细血管结构破坏的结果。
4. Kupffer细胞/单核巨噬细胞（KCs/MoMf）的极化与募集
KCs/MoMf的5个集群（Cls 5, 10, 17, 25, 26）展现出不同的功能状态。Cls 5（Vsig4+Clec4f+Ccr2-）代表常驻KCs，具有M1表型，在MASH-纤维化阶段显著增加。Cls 10在脂肪变性和MASH阶段富集，同时表达KCs和HEPs标志物。Cls 17则是另一个KCs/HEPs中间群体，在MASH-纤维化阶段增多。Cls 25高表达Adgre1和Ccr2，可能代表从循环中募集的单核巨噬细胞。Cls 26则同时表达KCs和ENDOs标志物，在MASH-纤维化阶段增多，可能具有M2样表型，参与组织修复。通路分析显示，在MASH-纤维化阶段，KCs/MoMf富集了白细胞跨内皮迁移、氧化磷酸化、糖酵解/糖异生、胆固醇代谢、RAP1和TNFα信号等通路。
5. 肝星状细胞（HSCs）的活化与肌成纤维细胞转化
HSCs主要形成两个集群：Cls 13和Cls 21。Cls 13是典型的HSCs，在疾病进展中高表达多种胶原、ECM和Pdgfrb信号基因。进一步将Cls 13分为6个子集群发现，其中的13_5亚群高表达Igfbp5、S100a6、Krt19，并富含细胞周期基因，符合肌成纤维细胞特征，且在MASH-纤维化阶段数量最多。Cls 21则是一个HSCs/ENDOs中间群体，主要存在于健康肝脏，同时表达HSCs标志物（如Reln, Lrat）和LSECs标志物。
6. 五种新型中间细胞群体的鉴定与验证
本研究的关键发现是鉴定了5个具有双重表型的中间细胞集群：
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Cls 15 (ENDOs/HEPs)：同时表达内皮标志物（Ptprb, Pecam1）和汇管区肝细胞标志物（Cps1, Alb）。主要存在于对照组和脂肪变性期，在MASH期消失。
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Cls 10 和 Cls 17 (KCs/HEPs)：同时表达KCs标志物（Vsig4, Clec4f）和肝细胞标志物（Cps1, Alb）。Cls 10富集于脂肪变性和MASH期，而Cls 17富集于MASH-纤维化期。
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Cls 26 (KCs/ENDOs)：同时表达KCs标志物（Adgre1, Vsig4）和内皮标志物（Ptprb, Pecam1）。在MASH-纤维化阶段显著增多。
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Cls 21 (HSCs/ENDOs)：同时表达HSCs标志物（Reln, Lrat）和内皮标志物（Ptprb, Pecam1）。
RNA速度（RNA velocity）分析和轨迹推断表明，这些中间细胞处于动态分化过程中。例如，从肝细胞Cls 4到内皮细胞Cls 1的分化轨迹经过中间态Cls 15；而Cls 10和Cls 17则可能代表了KCs与HEPs之间双向分化的不同阶段。
7. 空间蛋白质组学在小鼠和患者肝组织中的验证
为了在空间位置上验证这些中间细胞的存在，研究采用了MACSima成像循环染色（MICS）技术。在小鼠肝组织切片中，通过检测特定标志物的共定位，成功证实了这些中间细胞的存在：
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CD31/CD73双阳性细胞（对应Cls 21，HSCs/ENDOs）主要分布在对照组健康血管周围。
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CD31/CPS1双阳性细胞（对应Cls 15，ENDOs/HEPs）在疾病早期沿肝窦和血管分布。
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F480/CPS1双阳性细胞（对应Cls 10和17，KCs/HEPs）在MASH和MASH-纤维化阶段显著，位于损伤区域。
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F480/CD31双阳性细胞（对应Cls 26，KCs/ENDOs）在MASH-纤维化阶段出现于血管附近。
更重要的是，在人类正常肝组织和MASH-纤维化（F2期）患者的活检样本中，利用相同技术也观察到了这些中间细胞群体，其表达模式和空间分布与小鼠模型中的发现高度相似，从而将研究发现拓展至人类疾病。
讨论与结论
本研究通过整合sc-RNAseq、RNA速度分析和空间蛋白质组学，系统描绘了MASLD进展过程中肝脏细胞的动态演化图谱。研究不仅详细刻画了肝细胞、内皮细胞、Kupffer细胞和肝星状细胞等主要细胞类型在转录组和功能上的异质性变化，更重要的是，首次在小鼠和人类MASLD样本中鉴定并验证了五类新型中间细胞群体（HSCs/ENDOs, HEPs/ENDOs, KCs/ENDOs, HEPs/KCs）。这些中间细胞可能代表了细胞在慢性损伤压力下发生的表型转换或去分化/转分化状态，它们同时具备两种细胞类型的特征，可能在连接炎症、代谢紊乱、血管重塑和纤维化等关键病理过程中扮演着“桥梁”角色。例如，ENDOs-HSCs hybrids可能同时参与纤维启动和血管异常；而HEPs-KCs hybrids则可能将代谢失调与免疫反应联系起来。
这项研究极大地深化了对MASLD细胞基础的理解，揭示了疾病进展中复杂的细胞互作网络。这些新发现的中间细胞群体为未来开发针对特定疾病阶段或特定细胞亚群的精准治疗策略提供了潜在的崭新靶点。
