《Nano Today》：Label-free multispectral fluorescence lifetime imaging enables non-invasive diagnosis of Alzheimer’s disease in cerebral organoids
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3D代谢荧光寿命成像非侵入性阿尔茨海默病诊断平台|类脑器官模型|NADH荧光寿命|炎症氧化应激关联|FDA转化医学标准
Boram Son|Jeongmoo Han|Jihyeon Kang|Ildoo Jeong|Dahsom Han|Soonyong Kwon|Ara Jung|Hongki Yoo|Bomi Gweon|Hee Ho Park
韩国国立大学生物与发酵融合技术系，首尔02707
摘要
阿尔茨海默病（AD）是一个日益严重的全球健康问题，每年每位患者的管理费用超过5万美元，预计到2050年全球病例数将超过1.5亿例。迫切需要创新且可临床应用的诊断平台，这推动了基于先进纳米技术的方法的采用。本文介绍了一种无标记、多光谱荧光寿命成像显微镜（FLIM）平台，用于实时、无创地分析模拟AD的活体人脑类器官（COs）的代谢特征。我们建立了两种类型的COs：（1）来自携带PSEN1 M146I突变的hiPSCs的诱导型类器官；（2）来自家族性AD患者iPSCs的患者来源类器官。这两种模型均能准确再现AD的典型病理特征，包括β-淀粉样蛋白的积累和神经元成熟过程。FLIM技术能够检测到AD COs中NADH相关自荧光寿命的显著变化，这些变化与炎症和氧化应激的增加相关。这些内在的代谢特征可作为可靠的、无标记的AD生物标志物，为现有的侵入性临床诊断方法提供替代方案。我们的分子成像平台符合当前优先考虑使用人类来源模型和集成人工智能（AI）的监管趋势，并适用于神经退行性疾病建模、药物筛选和精准医疗等广泛领域。这项工作展示了纳米技术驱动的类器官成像在加速AD研究、诊断和治疗开发方面的变革潜力。
引言
阿尔茨海默病（AD）是一种致命的神经退行性疾病，全球有超过5000万人受其影响，其特征是认知能力逐渐下降和神经细胞退化，表现为记忆丧失、意识混乱以及日常生活活动受损[1]。AD的神经病理学特征包括细胞外的β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块和细胞内的神经纤维缠结（NFTs），后者由过度磷酸化的tau（p-Tau）蛋白组成[2]。AD分为家族性AD（fAD，占病例的不到5%）和散发性AD（sAD，占95%以上）[3]。尽管进行了大量研究，但其根本原因和有效治疗方法仍不清楚，因此需要继续深入探索[1]。在美国，目前有超过700万65岁及以上的老年人患有阿尔茨海默病，预计到2050年这一数字将接近1300万。阿尔茨海默病已成为美国第六大死亡原因，仅2022年就有超过12万人因此去世。该疾病带来的社会经济负担巨大：预计到2025年，阿尔茨海默病及其他痴呆症患者的年度医疗和长期护理费用将达到3840亿美元，到2050年可能接近1万亿美元[ref]。大多数阿尔茨海默病患者需要平均8-10年的长期护理，给医疗系统和护理人员带来巨大压力。尽管需求迫切，但目前如多奈哌齐这样的治疗方法仅能轻微缓解症状，最多能延缓认知衰退6-12个月。截至2024年，共有127种药物处于临床试验阶段，但自2002年以来只有少数几种（如lecanemab和donanemab）获得了FDA批准，这凸显了药物开发中的持续挑战[4]。通过使用细胞和动物模型，人们在揭示家族性（fAD）和散发性阿尔茨海默病（sAD）的复杂机制方面取得了显著进展[4]。虽然2D细胞模型能够显示Aβ斑块和NFT的形成，但由于缺乏神经网络的结构复杂性，它们无法在体内环境中完全再现这些现象[5][6]；动物模型虽然具有更高的生理相关性，但无法完全捕捉人类大脑的结构、功能和细胞多样性[7]。最近在动物模型中失败的抗Aβ疗法进一步表明，使用阿尔茨海默病小鼠模型来全面模拟人类AD病理存在挑战[8][9]。2024年4月，美国食品药品监督管理局（FDA）宣布逐步淘汰动物实验的计划，强调在药物开发中采用人类来源的模型（如类器官和器官芯片）和基于人工智能的新方法（NAMs）。这反映了科学界日益共识，即传统动物模型在预测人类疾病反应方面的可靠性有限，主要是由于物种间的差异[10]。在包括阿尔茨海默病在内的神经退行性疾病研究中，啮齿动物模型未能再现复杂的人类大脑病理，导致临床失败率较高[11]。传统的2D细胞模型也缺乏人类大脑复杂的神经网络结构，限制了其转化应用的价值[12]。因此，迫切需要开发基于人类细胞来源的脑类器官的先进技术用于AD研究。FDA推荐这些类器官作为核心NAMs技术，因为它们能够以准确的3D结构和人类特有的细胞多样性来模拟AD的病理生理过程[13]。特别是来自患者的AD脑类器官，为研究家族性和散发性AD的机制及疾病进展提供了基础[14]。从人类诱导多能干细胞（hiPSCs）生成的脑类器官已成为体外模拟AD病理的创新方法[10][11]。hiPSCs因其可获取性和生成疾病相关细胞类型的能力而受到重视，已被广泛用于多种人类疾病的建模[12][13]。这些自组装的3D类器官结构能够模拟特定器官或组织的特征，为在人类生理和发育背景下研究疾病表型提供了强大平台，减少了对动物模型的依赖，并缓解了相关的伦理和经济挑战[14][15][16][17]。最近在hiPSCs来源的脑类器官方面的进展极大地促进了包括阿尔茨海默病在内的神经系统疾病的建模[18]。这些类器官模型能够准确再现与AD相关的表型，反映遗传风险因素和患者特定的疾病特征[19]。在本研究中，我们使用来自hiPSCs的人类脑类器官来研究AD的诊断方法（图1）。这些三维结构能够再现人类大脑的关键结构，为研究疾病特异性标志物和开发诊断方法提供了可靠平台。AD的诊断依赖于Aβ斑块的逐渐积累，目前的诊断方法依赖于检测这些病理特征。然而，Aβ斑块的早期沉积（在认知障碍出现前15-20年）凸显了开发无创、实时监测方法的迫切需求[20]。目前，AD的诊断依赖于侵入性和昂贵的程序，如脑脊液（CSF）分析和正电子发射断层扫描（PET）成像，这些方法限制了诊断的可行性和早期检测能力。此外，Aβ斑块的积累在认知症状出现前15-20年就开始了，但缺乏无创、实时的监测技术阻碍了早期诊断。因此，迫切需要开发与人类来源模型兼容且适用于临床应用的无创诊断和代谢分析平台。将3D模拟AD的脑类器官与无创成像技术结合使用，有望实现早期诊断和代谢异常的检测，这是该领域的一项新技术进步[21]。荧光寿命成像显微镜（FLIM）利用内源性荧光团提供了一种无需标记即可探测这些代谢变化的方法。其中，NAD(P)H和FAD是关键的氧化还原辅因子，它们的荧光寿命和强度可以反映细胞的代谢状态和线粒体功能；与胶原蛋白相关的信号则可以反映与AD相关的细胞外基质重塑和微血管改变[21][22][23][24]。荧光寿命是指分子在发出荧光前保持激发状态的平均时间，为荧光强度信号提供了补充指标[25]。这种荧光分子的内在特性使得能够精确检测分子特征并监测目标分子的动态变化[26]。本文介绍了一种使用荧光寿命成像显微镜（FLIM）检测类器官内细胞内在荧光寿命的方法（图1），通过区分AD诱导类器官和正常类器官的独特内源性荧光信号，将这些信号作为新的诊断标志物。这种方法证明了无需对生物分子进行荧光标记即可进行AD诊断的潜力。通过将基因工程改造的患者来源类器官与先进的成像技术相结合，本研究突显了类器官在推进AD研究中的战略作用，特别是在诊断应用方面[27]。部分内容摘要
诱导型AD hiPSCs与正常hiPSCs及AD患者来源hiPSCs的比较
在本研究中，使用了两种类型的AD hiPSCs来生成AD脑类器官：诱导型AD hiPSCs和AD患者来源hiPSCs。图2A中的示意图展示了用于生成携带家族性AD相关突变基因PSEN1 M146I的hiPSCs的实验方案。与野生型PSEN1相比，突变基因PSEN1 M146I中的G被A替代，导致氨基酸水平上的甲硫氨酸（Met）被异亮氨酸（Ile）取代（图2B）。讨论
在家族性AD患者来源的hiPSCs中，AD相关突变基因在未分化状态下不会表达。这些基因仅在hiPSCs分化为脑类器官（COs）中的神经元、成熟并获得神经元特征后才会被激活，从而引发AD病理（pPSEN1 CO）。为了更精确地模拟这一患者模型，我们开发了一种可诱导的AD脑类器官模型（iPSEN1 CO），从而能够测试其适用性。结论
本研究旨在通过生成模拟AD病理的类器官模型（AD COs）并开发一种无标记、无创的AD诊断平台（使用FLIM）来克服现有AD诊断研究的局限性。我们首先建立了携带家族性AD相关突变基因PSEN1 M146I的hiPSCs（iPSEN1 hiPSCs），并将其特征与正常hiPSCs和AD患者来源的hiPSCs（pPSEN1 hiPSCs）进行了比较。随后，从iPSEN1 hiPSCs和pPSEN1 hiPSCs中生成了AD病理COs。正常hiPSCs的培养
hiPSCs由韩国国家干细胞银行（Korea National Institute of Health）提供。简而言之，该细胞系是通过使用Epi5? Episomal iPSC重编程试剂盒（Thermo Fisher Scientific，#A15960）将OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、LIN28和p53DD基因转染到人类外周血细胞中生成的。AD病理hiPSCs的生成与培养
为了构建AD病理hiPSC，将携带PSEN1 M146I突变基因的慢病毒转导到正常hiPSCs中。慢病毒生产过程中使用了特定的DNA混合物。CRediT作者贡献声明
Dahsom Han：研究、数据分析、数据整理、初稿撰写。Ildoo Jeong：资源获取、资金申请、审稿与编辑。Boram Son：初稿撰写、可视化、方法设计、数据分析、审稿与编辑、软件应用。Jeongmoo Han：初稿撰写、可视化、软件应用、方法设计、研究、数据分析、数据整理。Hee Ho Park：审稿与编辑、验证、监督、资源协调。利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。致谢
本研究部分得到了韩国政府（RS-2022-NR070365）资助的NRF项目的支持。此外，本研究还得到了韩国贸易、工业与能源部（MOTIE）资助的工业技术创新计划（RS-2024–00507755）以及韩国食品、农业和林业技术规划与评估研究所（IPET）通过高附加值食品技术开发计划的支持。
