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泰-萨克斯病研究显示AAV介导人Neu3基因治疗联合抗炎药可延缓双敲除小鼠神经退行性疾病进展，显著延长寿命至28周，改善运动功能并减少GM2积累和神经炎症。
Hande Bas?rl?|Volkan Seyrantepe
土耳其伊兹密尔理工大学，分子生物学与遗传学系
摘要
泰-萨克斯病（TSD）是一种由HEXA基因突变引起的神经退行性疾病，该基因编码β-己糖胺酶A的α亚基。HexA缺乏会导致GM2神经节苷脂的降解受损并积累，从而引发患者的进行性神经退行性病变。有趣的是，Hexa?/?小鼠表现出相对较轻的表型，这表明储存的GM2神经节苷脂通过一种涉及唾液酸酶的“旁路”途径进行降解。为了研究唾液酸酶Neu3是否参与GM2的降解，研究人员生成了同时缺乏HEXA和NEU3的小鼠，即Hexa?/?Neu3?/?。通过薄层色谱法和质谱分析发现Hexa?/?Neu3?/?小鼠的脑部存在异常的GM2积累。免疫组化和组织学分析显示星形胶质细胞增生、浦肯野细胞丢失以及进行性神经退行性病变。此外，这些小鼠还表现出明显的神经异常，包括运动迟缓、共济失调和震颤，且寿命缩短至约20周。因此，Hexa?/?Neu3?/?小鼠被认为是模拟患者神经病理和临床特征的早发性TSD模型。内源性人类Neu3在GM2降解中的作用尚不清楚。为了评估其治疗潜力，我们将AAVrh10-hNeu3通过鞘内注射给予8周大的Hexa?/?Neu3?/?小鼠，单独使用或与抗炎药物Istradefylline联合使用。治疗使小鼠的寿命延长至28周，体重增加，并减少了GM2的积累。此外，溶酶体中的LAMP1和TUNEL阳性细胞数量减少，CNPase水平升高。旋转棒测试和步态分析也显示出改善。我们的结果首次提供了体内证据，证明AAV介导的人类Neu3表达和Istradefylline可以减缓TSD小鼠模型的疾病进展、减轻神经病理变化并改善运动功能。
引言
泰-萨克斯病（TSD）是一种溶酶体贮积症（LSD），由HEXA基因突变引起。该基因编码β-己糖胺酶A的α亚基，这种酶负责分解GM2（Triggs-Raine等人，2001年）。这种酶的缺乏或缺失会导致大脑和脊髓神经元中GM2神经节苷脂的有害积累，从而引发神经元肿胀和进行性神经退行性病变。婴儿型TSD患者常出现癫痫发作、运动问题、肌肉无力，并通常在2至4岁之间因广泛的GM2积累和神经细胞丧失而死亡（Sango等人，1995年；Triggs-Raine等人，2001年）。最初使用Hexa缺陷的Hexa?/?小鼠（简称SKO）作为TSD模型；然而，它们在大脑中并不表现出显著的GM2积累或TSD患者的神经症状。SKO小鼠的寿命正常，在一年内不会出现明显的脑部异常（Sango等人，1995年；Yuziuk等人，1998年）。这种轻微的表型归因于神经胺酶的补偿作用，神经胺酶可以去除神经节苷脂上的唾液酸残基。由于神经胺酶Neu3也参与神经节苷脂的降解，因此推测神经胺酶Neu3介导的旁路途径可以防止Hexa?/?小鼠中的GM2积累。最近创建了一种新的模型——Hexa?/?Neu3?/?（简称DKO）小鼠，它们同时缺乏Hexa和Neu3基因。这些小鼠表现出进行性神经退行性病变、广泛的溶酶体GM2积累、神经炎症，并在约20周时过早死亡（Demir等人，2020年；Seyrantepe等人，2018年）。
尽管目前尚无有效的TSD治疗方法，但已针对其他溶酶体贮积症（LSD）研究了多种疗法。酶替代疗法（ERT）使用重组酶，在戈谢病（Barton等人，1991年）、法布里病（Eng等人，2001年）和庞贝病（Klinge等人，2005年）等病症中取得了成功。然而，将ERT应用于TSD具有挑战性，因为需要同时输送酶的α和β亚基。虽然工程化的HexA酶在体外实验中显示出 promising 的结果，但在体内的应用受到血脑屏障（BBB）的限制（Akeboshi等人，2007年）。药物伴侣疗法（PCT）可以稳定法布里病和戈谢病等LSD的错误折叠酶；然而，它对TSD无效（Clarke等人，2011年；Germain等人，2019年；Sánchez-Fernández等人，2016年）。底物减少疗法（SRT）使用miglustat在小鼠模型中显示出一定的效果，但在人类中仅能轻微改善神经症状（Bembi等人，2006年；Jacobs等人，2005年；Platt等人，1997年）。造血干细胞移植（HSCT）具有一定的神经保护作用，但受免疫并发症的限制（Stepien等人，2018年）。基因疗法，特别是使用腺相关病毒（AAV），在临床前LSD模型（如桑菲利波综合征B型）中显示出提高酶活性的潜力；然而，突破血脑屏障仍然是一个重大障碍。来自恒河猴的AAV血清型rh10已被证明能够成功输送到中枢神经系统（CNS），在神经元和星形胶质细胞中实现高转导水平，并逆转晚期婴儿神经蜡样脂质沉积症和异染性白质脑病的症状（Piguet等人，2012年；Sondhi等人，2007年；Tanguy等人，2015年）。
神经炎症特征，如星形胶质细胞增生、小胶质细胞增生以及趋化因子和细胞因子的水平升高，是许多神经退行性疾病的关键方面。星形胶质细胞增生被认为是桑德霍夫病、阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病等疾病的潜在生物标志物。Istradefylline（ISD）是一种FDA批准的药物，通过阻断腺苷A2A受体（A2AR）作为帕金森病的辅助疗法。使用桑德霍夫病（SD）模型（Hexb?/?小鼠）的研究表明，激活的星形胶质细胞中的A2AR表达增加。体外实验显示，激活星形胶质细胞中的A2AR会诱导CCL2的产生，这是一种参与神经炎症的趋化因子。ISD治疗抑制了这一途径，减少了SD小鼠大脑中的趋化因子和细胞因子的产生以及小胶质细胞的活化。这些结果突显了ISD作为抗炎剂的潜力，通过靶向星形胶质细胞的A2AR信号传导来治疗LSD（Ogawa等人，2018年）。
先前已经确定了小鼠神经胺酶Neu3在泰-萨克斯小鼠大脑中通过旁路机制促进GM2神经节苷脂降解的作用；然而，没有证据表明人类神经胺酶Neu3是否具有类似的效果。由于人类大脑中的内源性Neu3表达水平较低，我们旨在增强其表达，并确定增加人类Neu3活性是否有助于促进GM2神经节苷脂的降解并减轻TSD的病理变化。在这里，我们研究了在经过验证的DKO TSD小鼠模型中通过鞘内注射携带人类神经胺酶Neu3的AAVrh10（AAVrh10-hNeu3）的治疗潜力。此外，我们还评估了将基因疗法与抗炎药物ISD结合使用的效果，以评估其在减少神经炎症、延缓神经退行性和延缓疾病进展方面的作用。我们的发现支持开发结合基因疗法和抗炎药物的联合疗法，用于TSD和其他LSD。
小鼠
小鼠的繁殖和维护在土耳其伊兹密尔理工大学的土耳其动物护理委员会（TCAC）进行，这是一个经过认证的动物设施。所有涉及动物的程序都得到了伊兹密尔理工大学机构动物护理和使用委员会的批准，并遵循土耳其动物健康研究所制定的实验室动物护理和使用指南。动物被安置在……
使用小鼠神经胶质细胞的AAV转导实验
对20周大的DKO小鼠的神经胶质细胞进行AAV转导后，7天出现了红色荧光信号，证实了体外中AAV的成功分离。随后我们对AAV转导后的DKO小鼠的神经胶质细胞进行了抗-GM2染色，证明了hNeu3对GM2神经节苷脂降解的体外效果（见补充图1）。
AAV和ISD对DKO小鼠存活率和体重的影响
生存曲线分析显示，DKO小鼠在20周时死亡，而接受AAV或联合治疗的DKO小鼠……
讨论
最初的SKO TSD模型表现出有限的GM2积累，并且寿命正常，最长可达一年（Sango等人，1995年；Yuziuk等人，1998年）。由于神经胺酶Neu3可以降解神经节苷脂，因此考虑了其在SKO小鼠中通过旁路机制将GM2神经节苷脂降解为下游GA2神经节苷脂的作用。最近生成的DKO小鼠表现出进行性神经退行性病变、神经炎症和行为异常，并在20周时过早死亡……
结论
总之，我们证明了在DKO小鼠的特定脑区中通过AAVrh10驱动hNeu3的表达，无论是单独使用还是与ISD联合使用。我们的结果首次提供了体内证据，证明了人类Neu3在部分降解GM2神经节苷脂、减轻溶酶体和神经炎症变化、延缓神经元死亡以及延缓TSD小鼠模型中运动功能衰退方面的作用。这些效果与显著的寿命延长相关，表明……
CRediT作者贡献声明
Hande Bas?rl?：撰写——原始草案，研究。
Volkan Seyrantepe：撰写——审稿与编辑，监督，方法学，研究，资金获取，概念构思。
伦理批准
已获得土耳其伊兹密尔理工大学伦理委员会的伦理批准。
资金
本研究部分由TURKIYE-FRANCE双边协议博斯普鲁斯项目资助（资助编号：120N552）。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
如果还有其他作者，他们也声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
HB获得了120N552项目下的奖学金支持。作者感谢伊兹密尔理工大学分子生物学与遗传学系的Melike Can ?zgür博士提供的宝贵建议。
