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本研究综合运用粪便DNA分子标记-重捕获（CMR）、微卫星、单核苷酸多态性（SNP）和性别鉴定技术，对柬埔寨东部平原景观（EPL）内普列奇山（PPWS）和斯雷博克（SWS）两个相邻保护区的野生亚洲象种群进行了首次联合评估。结果显示，该联合种群是柬埔寨现存规模最大的象群，普查种群大小（Nc）估计为381.5头，但有效种群大小（Ne）仅为59.8，且幼年个体比例低（5.2%），国家公路76号可能已造成种群分隔。研究证实SNP标记可有效提升粪便DNA鉴定成功率，为亚洲象等珍稀濒危森林物种的种群监测提供了新方法，并强调了加强栖息地连通性与减少人为干扰对种群长期存续的紧迫性。
1 引言
亚洲象（Elephas maximus）是全球濒危物种，在柬埔寨、老挝和越南等国，其种群在过去50年间急剧衰退，目前各国境内个体数均少于1000头。柬埔寨是近期亚洲象栖息地流失最严重的国家之一，主要归因于伐木、农业和种植园扩张。可靠的种群数据，特别是普查种群大小（Nc）、有效种群大小（Ne）和分布信息的缺乏，严重制约了国家层面的种群状态、生存力及趋势评估。对分布广泛、密度低、栖息于森林的亚洲象进行监测充满挑战，而从大象粪便中提取并扩增DNA片段的技术为应对此挑战提供了可能。然而，样本年龄、环境条件、存储状况以及不同基因检测方法等因素显著影响DNA质量和基因分型成功率。单核苷酸多态性（SNP）标记因其可使用更短的DNA片段进行更多位点的分型，在降解样本中能提高个体区分率并减少基因分型错误，显示出巨大潜力。本研究旨在测试微卫星与新型SNP标记的联合应用，以描述柬埔寨东部象群的种群参数。
2 材料与方法
2.1 调查区域
研究在柬埔寨东部平原景观（EPL）内两个相邻的保护区进行：普列奇山野生动物保护区（PPWS）和斯雷博克野生动物保护区（SWS）。两者植被类型包括落叶龙脑香林、半常绿林和常绿林等。
2.2 调查与采样
调查于2015年旱季高峰期（2月6日至5月15日）进行，共6次独立采样事件，每次持续10天，采用圆形热点区和矩形样块法搜索大象粪便。共收集778份粪便样本，通过测量最大粪球周长来划分年龄等级，并采集样本外层约10克放入裂解缓冲液中保存。
2.3 DNA提取与分型
使用试剂盒提取DNA。微卫星分型使用了11个已发表的位点，SNP分型使用了竞争性等位基因特异性PCR（KASP）方法对20个双等位SNP位点进行分型。性别鉴定则采用针对Y染色体和X染色体特异性片段的引物进行PCR扩增。
2.4 遗传分析
通过评估等位基因缺失、零等位基因频率、多态信息含量等指标筛选有效标记。使用等位基因匹配软件进行个体唯一性鉴定。采用RMark和CAPWIRE软件进行闭锁种群的标记-重捕获（CMR）分析以估计种群普查大小（Nc）。通过公式NeD= (4 × 雄性数 × 雌性数)/(雄性数 + 雌性数)计算 demographic effective population size (NeD)，并使用NeEstimator软件基于连锁不平衡法计算遗传有效种群大小（Ne）。
3 结果
3.1 采样与分布
大象活动痕迹分布在37个采样区中的32个。共收集778份粪便样本。访谈和遗传数据均未发现大象在调查期间穿越国家公路76号的证据，表明该公路可能已将SWS内的象群分隔。
3.2 基因分型与个体鉴定
微卫星分型成功率较低，仅有204个样本在≥6个位点成功分型。SNP分型成功率相对较高。最终，结合两种标记的数据集从207份野生样本中鉴定出156个独特基因型。所有遗传标记均呈多态性，未显著偏离哈迪-温伯格平衡。
3.3 种群结构与规模
156个个体中，成年象占56.8%，亚成年象占38.1%，幼年/少年象仅占5.2%。性别比例均衡（1:1）。重捕获分析未发现基因型在公路两侧交叉出现。基于RMark的Mt模型，整个联合种群的普查大小（Nc）估计为381.5头，PPWS和SWS两个地理组群分别估计为185.1头和162.2头。联合种群的有效种群大小（Ne）估计为59.8，其中PPWS组为44.3，SWS组仅为20.0。 demographic effective population size (NeD) 估计为71.5。瓶颈效应分析未发现近期种群瓶颈的证据。
4 讨论
4.1 低质量DNA、遗传标记性能与提升分型成功率
尽管采用了优化的采样方法和标记，本研究粪便DNA的扩增失败率仍然很高，可能与样本存储、提取延迟等多种因素有关。然而，微卫星与SNP标记的结合增加了可用样本和位点的数量，提升了个体鉴定和种群估计的准确性。SNP标记单独或联合使用，在提升降解粪便样本基因分型率方面展现出应用前景。
4.2 种群规模、分布范围与区域重要性
本研究对PPWS的种群估计高于2009年的研究，并对SWS首次提供了可靠的种群估计，两者共同构成了柬埔寨已知的最大象群。与邻国老挝、越南的最大已知种群相比，EPL（包括柬埔寨和越南部分）可能支持超过500头大象，使其成为具有全球重要性的象群。可用栖息地分析表明，若栖息地完整性得以维持，种群有恢复潜力，但非法活动和人为干扰可能阻碍大象利用这些生境。
4.3 年龄结构
本研究中幼年象比例（5.2%）显著低于柬埔寨其他保护区及邻国种群的报告。广泛的套索使用可能导致幼象伤亡率高，加之森林中幼象尸体难以发现，可能共同导致了观测到的低幼年比例，这加剧了种群衰退的风险。
4.4 有效种群大小
联合种群的Ne和NeD估计值（约60-72）远低于避免近交衰退和维持长期进化潜力所推荐的阈值（Ne> 100 和 > 1000）。各地理组群的Ne均低于50，表明即使合并后的PPWS-SWS种群也未必能长期存续，凸显了采取针对性保护行动的紧迫性。
5 结论与建议
本研究是亚洲大陆首批证明结合微卫星和SNP数据集可提升降解粪便样本遗传数据质量的大型哺乳动物研究之一，为亚洲象种群监测提供了统一且可行的标记组。调查证实PPWS-SWS联合种群是柬埔寨、老挝、越南三国中已知规模最大的，但各参数（Nc、Ne、NeD）均低于长期存续所需阈值，且幼年个体比例低，种群面临严重风险。为确保这个具有区域重要性的种群存续，建议：加强巡护与执法以遏制盗猎（特别是套索）和栖息地破坏；评估并减轻农业扩张、开发项目及线性基础设施的累积影响；在国家公路76号历史通道处设置减速带和警告标志；维护和恢复保护区间的森林连通性以促进基因交流。未来应在整个跨界景观范围内进行协调一致的DNA调查，并利用卫星颈圈研究大象的季节性移动模式，为制定科学的保护干预措施提供关键信息。
