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本研究首次揭示了钙激活氯通道（CaCC）TMEM16A/ANO1在小鼠卵母细胞和早期胚胎发育中的关键作用。通过电生理学、钙成像和蛋白质组学技术，研究者证实由硫柳汞模拟的受精相关Ca2+振荡可激活TMEM16A，进而驱动卵母细胞膜电位（Em）超极化。文章指出，抑制TMEM16A可显著降低超极化反应并损害胚胎向囊胚阶段的发育，为理解哺乳动物受精及胚胎早期发育的离子通道机制提供了新的关键证据。
在哺乳动物中，成熟的卵母细胞排卵时停滞在第二次减数分裂中期（MII）。受精会引发一系列瞬态的细胞内钙离子浓度（[Ca2+]i）振荡，这些振荡对于卵母细胞激活至关重要，可触发诸如MII停滞退出、皮层颗粒胞吐和有丝分裂细胞分裂启动等一系列事件。精子通过将磷脂酶C ζ（PLCζ）注入卵母细胞来启动钙变化。除了钙振荡，受精还伴随着卵母细胞质膜电特性的变化，即膜电位（Em）超极化，但其启动机制和生理作用尚不完全明确。
钙激活氯通道（CaCCs）在许多细胞类型中表达，并具有多种生理功能。最初在非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞中发现，在受精诱导的[Ca2+]i增加时被激活，导致膜电位去极化并形成快速多精受精阻断。TMEM16家族有10个成员，但只有TMEM16A/Ano-1和TMEM16B/Ano-2被确认为CaCCs。然而，由于缺乏这些通道的特异性抑制剂，对其功能表征一直存在困难。
本研究使用硫柳汞来激活小鼠卵母细胞中的[Ca2+]i振荡，以模拟受精诱导的振荡。通过荧光成像和全细胞膜片钳技术分别分析了CaCC抑制剂对[Ca2+]i振荡和钙诱导的Em超极化的影响，并检测了卵母细胞和早期胚胎中TMEM16A的表达。
硫柳汞诱导由[Ca2+]i增加引起的Em超极化
化学刺激物可用于模拟精子诱导的[Ca2+]i振荡，是研究[Ca2+]i振荡潜在机制的有用工具。硫柳汞是一种氧化IP3受体上巯基的试剂，从而使其对钙离子敏感。本研究中使用了硫柳汞，因为它能触发[Ca2+]i振荡，而不是像其他化学物质（如钙离子载体）那样触发单次钙峰。初步实验证实了硫柳汞对小鼠卵母细胞[Ca2+]i和Em的影响。硫柳汞（200 μM）诱导了重复性的[Ca2+]i振荡。卵母细胞的穿孔膜片钳记录显示，硫柳汞在静息Em的整体去极化基础上，诱导了重复性的Em超极化。使用钙离子螯合剂BAPTA-AM证实了[Ca2+]i振荡在硫柳汞激活超极化中的作用。所有经BAPTA-AM预处理的卵母细胞在硫柳汞存在下均未显示出[Ca2+]i变化或Em超极化。
钾离子通道抑制不能阻止硫柳汞诱导的Em和[Ca2+]i变化
Em的超极化可能是由于钾离子外流或氯离子内流穿过卵膜。由于在仓鼠卵母细胞中，受精诱导的超极化是由钙依赖性钾电导激活引起的，本研究调查了广谱钾离子通道阻滞剂TEA对小鼠卵母细胞中硫柳汞诱导的钙和Em振荡的影响。单独添加TEA对静息[Ca2+]i或Em没有影响。在TEA存在下添加硫柳汞诱导的[Ca2+]i和超极化，在数量和外观上与单独使用硫柳汞时观察到的相似。然而，第一个Em超极化的平均幅度在TEA存在时显著减小。
DIDS减少硫柳汞诱导的Em和[Ca2+]i变化
已知在非洲爪蟾卵母细胞和小鼠胚胎中，Em变化是由CaCC活性引起，并可被广谱氯离子通道阻滞剂DIDS阻止。单独添加500 μM DIDS对小鼠卵母细胞的静息[Ca2+]i或Em没有影响。随后在500 μM DIDS存在下添加硫柳汞引起的[Ca2+]i振荡和超极化，其数量与硫柳汞单独诱导的相比显著减少。DIDS存在时第一个Em超极化的幅度与硫柳汞单独使用时的幅度没有差异。
抑制电压门控氯离子通道对硫柳汞诱导的[Ca2+]i和Em变化无影响
评估了9AC对Em和[Ca2+]i变化的影响，以排除电压门控氯离子通道（VGCC）的作用，该通道也存在于小鼠卵母细胞中。9AC对静息[Ca2+]i或Em没有影响，对硫柳汞诱导的[Ca2+]i振荡或超极化数量也没有影响。9-AC存在时第一个Em超极化的平均幅度与硫柳汞单独使用时的幅度没有差异。
NFA抑制硫柳汞诱导的[Ca2+]i和Em变化
尼氟酸（NFA）是一种选择性更高的CaCC阻滞剂，可抑制多种细胞类型（包括非洲爪蟾卵母细胞和小鼠2细胞期胚胎）中的CaCCs。单独添加100 μM NFA对静息[Ca2+]i或Em没有影响，但显著减少了硫柳汞诱导的[Ca2+]i振荡和超极化数量，并导致基础钙水平持续升高和Em去极化。NFA存在时第一个Em超极化的幅度也显著减小。
TMEM16A在硫柳汞诱导的Em变化中的作用
CaCC Anoctamin-1（ANO1）或TMEM16A已被证明是非洲爪蟾卵母细胞中钙诱导超极化的原因，并且该通道可被小分子抑制剂T16Ainh-A01阻断。因此研究了TMEM16A在小鼠卵母细胞对硫柳汞反应中的作用。单独添加10 μM T16Ainh-A01对静息[Ca2+]i或Em没有影响。在10 μM T16Ainh-A01存在下添加硫柳汞，对所诱导的[Ca2+]i振荡数量没有影响，而Em超极化数量显著减少，第一个超极化的幅度也减小。
TMEM16A在卵母细胞和所有植入前胚胎阶段表达
由于T16Ainh-A01降低了Em超极化，通过蛋白质印迹和免疫荧光检测了小鼠卵母细胞和胚胎中TMEM16A的表达。人前列腺癌细胞（PC-3）用作蛋白质印迹的阳性对照。在卵母细胞和植入前发育的所有阶段都检测到约140 kDa的条带。免疫荧光染色也显示TMEM16A在所有阶段均有表达，在卵母细胞中染色集中在卵膜下的皮质区域。在受精卵、2细胞、4细胞和8细胞阶段，TMEM16A染色均匀分布在整个细胞质中。在桑葚胚和囊胚中，TMEM16A染色与其他阶段相比弱得多，这与蛋白质印迹中这些阶段条带强度降低相对应。
抑制TMEM16A可阻止受精卵发育至囊胚阶段，但从桑葚胚阶段开始培养则无影响
为了进一步确定CaCC在发育中的作用，研究了在T16inh-A01中培养受精卵的效果。在2 μM T16Ainh-A01存在下培养可降低发育至桑葚胚和囊胚阶段的比例，而3 μM也降低了发育至4细胞阶段的比例。在5 μM T16Ainh-A01中培养受精卵，与对照相比，降低了分裂至2细胞阶段的比例，并阻止了向后期阶段的发育。在10 μM T16Ainh-A01存在下未观察到胚胎发育。当新分离的2细胞和4细胞阶段胚胎在10 μM T16Ainh-A01存在下培养时，0%的胚胎发育至囊胚，而对照组的这一比例为90%。相比之下，10 μM T16Ainh-A01对桑葚胚发育至囊胚阶段没有影响。
讨论
本研究显示，巯基试剂硫柳汞诱导小鼠卵母细胞中伴随[Ca2+]i振荡的Em超极化，模拟了精子在受精时诱导的变化。在仓鼠卵母细胞中，钙依赖性钾电流导致了大的、重复性的Em超极化，但在本小鼠卵母细胞研究中，钙依赖性钾离子通道抑制剂TEA并不能阻止硫柳汞诱导的重复性超极化。只有第一个超极化的幅度被TEA减小，这表明钙依赖性钾离子通道可能有助于启动Em超极化。
氯电导在调节哺乳动物卵母细胞和胚胎的静息膜电位中也起主要作用。根据测量到的细胞内和细胞外氯离子浓度，卵母细胞中氯离子的平衡电位预计约为-70 mV。因此，导致硫柳汞诱导超极化的外向电流可能是由氯离子进入卵母细胞引起的。然而，电压门控氯离子通道抑制剂9AC对硫柳汞诱导的Em超极化没有影响。相反，Em超极化被CaCC阻滞剂DIDS和NFA阻止。
在植入前哺乳动物胚胎中，CaCC活性的证据有限。本研究表明，TMEM16A CaCCs可能是受精过程中小鼠卵母细胞Em超极化的原因，这类似于非洲爪蟾卵母细胞的情况，其中TMEM16A负责受精后Em调节和快速多精受精阻断。然而，本研究中的Em超极化并未被T16Ainh-A01完全抑制，这表明可能存在额外的CaCC，例如TMEM16B，它不受T16Ainh-A01阻断，仅被NFA部分阻断。TMEM16A抑制剂的效力似乎也具有细胞类型特异性，可能需要更高浓度的抑制剂才能完全阻断小鼠卵母细胞中的通道。或者，超极化的启动可能依赖于钙依赖性钾离子通道，因为TEA减小了第一个超极化的幅度，而随后的重复性超极化则由TMEM16A介导。
蛋白质印迹证实TMEM16A蛋白在胚胎发育的所有阶段均有表达，在桑葚胚和囊胚阶段水平降低。检测到的分子量约为140 kDa。在卵母细胞中，TMEM16A的免疫染色显示其存在于质膜上，而在受精后，该蛋白位于细胞内，可能定位于内质网或线粒体膜。在T16Ainh-A01存在下体外培养小鼠胚胎，可阻止从受精卵、2细胞和4细胞阶段开始的胚胎发育，但对桑葚胚发育至囊胚没有影响，这表明TMEM16A通道在胚胎的致密化前阶段以及卵母细胞中具有作用。
DIDS和NFA也减少了硫柳汞诱导的[Ca2+]i振荡数量，并导致整体[Ca2+]i升高且未恢复至基础水平。氯离子在通过作为钙离子移动的反向离子来补充内质网钙储存方面起着重要作用。因此，抑制CaCCs可能会改变氯离子进入内质网的梯度，从而阻止钙离子的重摄取，导致观察到的[Ca2+]i持续升高。或者，在DIDS和NFA存在下观察到的Em整体去极化可能导致钠钙交换器的反向电转运，导致钙离子流入卵母细胞而不是流出。这些非特异性CaCC抑制剂也可能通过直接激活释放机制引起内质网和/或线粒体钙储存释放钙离子。
尽管已知受精诱导的[Ca2+]i振荡会导致Em超极化，但无法确定TMEM16A在受精中的作用，因为该通道也存在于精子中，参与精子获能和顶体反应。已产生TMEM16A基因敲除小鼠，但出生后一个月内死亡。由于敲除小鼠是通过杂合子交配产生的，父本和母本TMEM16A蛋白的存在可能支持了敲除小鼠的受精和正常植入前胚胎发育。需要使用卵母细胞特异性敲除TMEM16A的进一步实验来确认TMEM16A及其超极化在受精中的作用。
总之，本研究首次提供了证据，表明CaCC TMEM16A/Ano-1在QS小鼠卵母细胞中表达，并且该通道有助于响应细胞内钙离子振荡的Em超极化。
