单细胞多组学揭示髓外多发性骨髓瘤肿瘤微环境的免疫景观：高比例CD8+T细胞耗竭与CD16–NK细胞富集

《Blood Cancer Discovery》：Study design and the overall composition of EMM tumors and the multiple mye... Open Access

本综述通过对髓外多发性骨髓瘤（EMM）肿瘤微环境的全面单细胞分析，揭示了与骨髓内骨髓瘤相比，EMM具有显著降低的效应细胞/肿瘤细胞（E:T）比、更高比例的耗竭性肿瘤反应性CD8+T细胞，以及高比例的细胞毒性较低的调节性CD16–NK细胞。研究表明，EMM细胞与CD8+T细胞间的直接相互作用可能驱动了T细胞耗竭，这为理解EMM对现代免疫疗法（如单克隆抗体、双特异性抗体、CAR-T细胞）的抵抗机制及开发新治疗策略提供了重要见解。

　　

髓外多发性骨髓瘤（EMM）是多发性骨髓瘤的一种高风险临床表现，与对包括现代免疫疗法在内的多种治疗抵抗性增加及生存期缩短相关。然而，人们对其肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的组成和功能状态仍知之甚少。本项研究综合运用了单细胞RNA测序（scRNA-seq）、流式细胞术（FCM）和空间转录组学（ST）三种技术，对EMM病变及其配对的骨髓（BM）样本进行了深入分析，揭示了EMM TME与骨髓内多发性骨髓瘤（BM）环境之间的显著差异。

患者特征与研究方法

研究纳入了23例EMM肿瘤样本、12例来自EMM患者的独特BM样本（其中9例与EMM样本配对），以及26例来自无EMM证据的复发/难治性多发性骨髓瘤（RRMM）患者的BM样本。所有队列在性别、国际分期系统（ISS）分期、既往治疗线数等临床特征上均衡。值得注意的是，EMM患者在采样时年龄明显更轻，且复发时BM浆细胞（BMPC）水平显著更低，而乳酸脱氢酶（LDH）水平则更高。

EMM肿瘤与BM微环境的整体组成

scRNA-seq和FCM分析一致表明，EMM肿瘤主要由恶性浆细胞（PC）、T细胞和NK细胞构成，而髓系细胞浸润极少。与RRMM BM样本相比，EMM样本中的效应细胞/肿瘤细胞（E:T）比显著降低。此外，EMM样本中恶性PCs处于S-G₂-M期的比例更高，表明其增殖更为活跃。与之形成对比的是，来自EMM患者的BM样本（EMM_BM）中恶性PC浸润极少，主要成分为中性粒细胞、T细胞、单核/巨噬细胞和NK细胞。与无EMM的RRMM患者的BM相比，EMM_BM样本中恶性PCs和B细胞比例更低，而细胞毒性较强的CD8⁺T细胞亚群比例更高。

T细胞和NK细胞亚群的多样性

通过对T/NK细胞簇的深入解析，研究鉴定出14个不同的亚群，包括12个T细胞簇和2个NK细胞簇。NK细胞被分为细胞毒性CD16⁺亚群和调节性CD16^–亚群。与BM样本相比，EMM肿瘤中CD4⁺T细胞浸润有限，主要为调节性T细胞（Treg）、CD4效应和CD4初始T细胞。

EMM肿瘤中的CD8⁺T细胞更易耗竭

与配对的BM样本相比，近半数的EMM样本显示出明显升高的T细胞耗竭评分，且耗竭评分与细胞毒性评分呈强负相关。一个被鉴定为CD8耗竭样TOX的亚群几乎只出现在EMM样本中，该亚群不仅耗竭评分高，还表现出更强的肿瘤新抗原反应性T细胞特征。相反，具有最高细胞毒性评分的CD8效应亚群在EMM中则显著减少。FCM分析进一步证实，EMM样本T细胞中PD-1（PDCD1）阳性的比例更高。此外，在EMM和BM样本中，初始CD8⁺和CD4⁺T细胞的比例呈现逐渐降低的趋势。

T细胞耗竭可能由直接细胞间相互作用驱动

为探究EMM中T细胞耗竭评分高变异性的潜在驱动因素，研究者比较了高耗竭与低耗竭患者组间的差异细胞-细胞相互作用。分析显示，高耗竭组中EMM细胞与CD8⁺T细胞间的HLA-B:CD8A相互作用更强，这源于高耗竭组EMM细胞中HLA-B、HLA-A和HLA-C基因的显著高表达。结合CD8耗竭样TOX簇的高新抗原反应性特征，这些发现提示EMM中的T细胞耗竭可能是由肿瘤PCs与T细胞之间的直接相互作用所驱动的。

EMM肿瘤微环境中调节性CD16^–NK细胞比例增加

EMM样本的一个突出特征是，与BM样本相比，其CD16^–NK细胞的比例显著更高。scRNA-seq显示，约30%的EMM肿瘤中的CD16^–NK细胞处于细胞周期的S-G₂-M期，表明它们存在局部扩增。更重要的是，这些细胞中抑制性受体KLRC1（NKG2A）的表达显著升高。空间转录组学分析在一个独立的验证队列中证实了CD16^–NK细胞在EMM病变中的富集，且它们分散在整个病灶中，无特定的聚集模式。

EMM患者与无EMM患者的BM微环境差异

由于EMM患者的BM中通常几乎检测不到恶性PCs，研究进一步比较了EMM_BM与RRMM_BM样本。结果显示，EMM_BM中恶性PCs和B细胞的比例显著更低，而高细胞毒性的CD8效应亚群比例更高，CD8效应记忆（EM）亚群比例则更低。在髓系区室中，两组间未发现显著差异。这些差异可能仅仅反映了EMM患者BM中肿瘤负荷极低的状态。

讨论与总结

本研究首次对EMM肿瘤微环境进行了全面的单细胞分析，并与配对的BM样本进行了直接比较。核心发现是，EMM TME的特征是极低的E:T比、伴随细胞毒性功能受限的高比例耗竭性CD8⁺T细胞，以及高比例的调节性CD16^–NK细胞。低E:T比和功能失调的免疫效应细胞，可能共同导致了EMM对依赖T/NK细胞功能的现代免疫疗法（如单克隆抗体、双特异性抗体）的反应不佳。研究数据支持T细胞耗竭源于与肿瘤细胞的直接相互作用，这为联合使用免疫检查点抑制剂（如抗PD-1、抗NKG2A）来重新激活抗肿瘤免疫提供了理论依据。同时，CD16^–NK细胞的富集及其高表达NKG2A，进一步解释了为何依赖抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的抗CD38单抗（如达雷妥尤单抗）在EMM中疗效有限。总之，这项工作深入刻画了EMM的免疫抑制性微环境，为其治疗抵抗性提供了新的机制见解，并为未来开发更有效的EMM联合治疗策略指明了方向。