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本研究旨在解决HPV阴性头颈鳞状细胞癌(HNSCC)因肿瘤微环境(TME)高度异质性导致治疗响应不一、患者预后不佳的难题。研究人员通过整合六个公开数据集，构建了包含54名患者、超过23万个细胞的单细胞RNA测序(scRNA-seq)图谱，系统解析了免疫、间质、内皮及上皮等细胞区室，发现了既往未充分探索的IL1B+髓系细胞亚群，澄清了常被混淆的癌症相关成纤维细胞(CAF)群体，并揭示了细胞类型比例与临床表型(如性别、分期)间的关联。该图谱为深入理解HPV阴性HNSCC的肿瘤异质性提供了宝贵的公共资源，并为发现新的治疗干预靶点奠定了基础。
头颈癌是全球第七大常见癌症，其中不依赖人乳头瘤病毒(HPV)感染的亚型，即HPV阴性头颈鳞状细胞癌(HNSCC)，占据了总病例的75%。这类癌症通常与吸烟、饮酒等风险因素相关，与HPV阳性亚型相比，其预后更差，五年生存率仅为55%左右。更棘手的是，即便同是HPV阴性HNSCC，不同患者对放疗、化疗乃至新兴的免疫检查点抑制剂(ICI)等治疗的反应也存在巨大差异。这背后，肿瘤及其微环境(TME)中细胞构成与分子特征的惊人异质性，被认为是导致治疗抵抗和预后不佳的关键“幕后黑手”。为了从细胞层面绘制这幅复杂的“肿瘤生态图”，理解各类细胞如何相互作用、影响疾病进程，并为寻找个体化治疗新靶点提供线索，研究人员迫切需要一份高分辨率、大样本的“地图”。然而，此前的研究要么样本量有限，要么聚焦于单一细胞类型或疾病进展的特定阶段，尚缺乏一份全面、整合性的HPV阴性HNSCC细胞图谱。为此，Kroehling等人开展了一项雄心勃勃的整合分析研究，并成功构建了当前规模最大的HPV阴性HNSCC单细胞图谱，相关成果发表在《Communications Medicine》上。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下关键方法：他们从公共数据库收集并整合了六个已发表的HPV阴性HNSCC单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集，涉及54名未经治疗的患者，共计超过23万个细胞。利用Seurat软件包进行数据预处理、整合（采用rPCA方法）和细胞聚类分析。通过SingleR工具结合Blueprint和人类原代细胞图谱(HPCAD)数据库对细胞类型进行注释。使用InferCNV进行拷贝数变异(CNV)分析以区分癌细胞与正常上皮细胞。应用K2Taxonomer对免疫和上皮区室的细胞类群进行层级关系（分类学）组织。利用CellChat软件推断细胞间通讯网络。采用sccomp工具分析细胞类型比例与临床特征（如性别）的关联。通过多种基因集富集分析（如KEGG、Hallmark）解析不同细胞亚群的生物学功能。
结果
生成整合图谱：研究成功整合了六个数据集，涵盖54名患者、232,015个细胞。整合后的UMAP图谱显示，数据集间有效混合，且基于标记基因的细胞类型注释清晰可分，同时揭示了患者间和患者内显著的细胞类型构成异质性。
分离免疫与非免疫区室：鉴于部分数据集进行了预分选，研究人员将图谱分为免疫（CD45阳性）和非免疫（CD45阴性）两个区室分别进行深入分析。
免疫区室：在免疫区室中，研究人员识别出30个聚类，并将其归纳为髓系、T/NK细胞、B细胞、浆细胞和肥大细胞五大类。通过已发表的基因特征对T细胞区室进行评分，进一步鉴定出初始T细胞、滤泡辅助性T细胞(Tfh)、调节性T细胞(Treg)、中央记忆T细胞(Tcm)等CD4+亚群，以及细胞毒性、中央记忆和功能失调的CD8+T细胞亚群，还有自然杀伤(NK)细胞和增殖性T细胞。通过计算“效应能力评分”（细胞毒性评分减去功能失调评分），发现CD8+T细胞的效应能力与肿瘤早期分期(T1)呈显著正相关，提示早期存在更强的细胞毒性T细胞应答。利用CytoTRACE2工具预测发现，初始T细胞和增殖性T细胞被归类为具有分化潜能的“寡能”状态。K2Taxonomer分析揭示了免疫细胞簇之间的层级关系，例如单核细胞簇形成独立分支，而巨噬细胞与常规树突状细胞(cDC)因高表达补体基因而关系更近。对患者间细胞类型比例的相关性分析发现，初始T细胞与细胞毒性T/NK细胞、CD14+单核细胞呈正相关，而Treg、Tfh和功能失调T细胞三者彼此高度正相关。
巨噬细胞注释解析亚型：对巨噬细胞进行高分辨率聚类，鉴定出六个亚群。其中两个亚群高表达经典巨噬细胞标记物，并可分别由CXCL9和SPP1定义，支持了巨噬细胞极化超越经典M1/M2框架的新认知。另外发现一个独特的IL1B+髓系亚群，其特征是高表达IL1B、IL6、IL10等炎症因子，缺乏SPP1和CXCL9表达，且富集细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。细胞通讯分析显示，该亚群特异性地发出血小板反应蛋白(THBS)信号，且肿瘤坏死因子(TNF)和IL-1β信号通路活性高于SPP1+和CXCL9+巨噬细胞。该亚群在之前的HNSCC研究中未被充分探索。此外，还识别出一个以S100A8、HCAR3等为标记的中性粒细胞群。
非免疫区室：在非免疫区室中，聚类分析识别出16个簇，包括血管/淋巴内皮细胞、三个成纤维细胞(CAF)簇、七个肿瘤上皮细胞簇和四个唾液腺细胞簇。
上皮区室表征与肿瘤细胞鉴定：利用InferCNV分析拷贝数变异，计算每个细胞的“恶性程度评分”，从而区分癌细胞和正常上皮/唾液腺细胞。不同上皮簇的恶性评分差异显著。通过标记基因和特征评分，研究人员描绘了上皮细胞的分化轨迹：Epi1（表达CD44、KRT18，富集部分上皮-间质转化(pEMT)特征）分化程度最低，最具可塑性；Epi6（表达KRT5, KRT14）代表基底细胞；Epi5和Epi4则代表更分化的状态。CytoTRACE2分析也证实Epi1的细胞“潜能”评分最高。K2Taxonomer分析显示，上皮细胞主要按基质和上皮分组，但部分上皮簇(如Epi7)与基质细胞关系更近。值得注意的是，Epi2、Epi3和Epi5等上皮簇具有明显的患者特异性。相关性分析表明，最具可塑性的Epi1细胞与基质细胞的比例变化趋势更一致。通过映射空间转录组数据定义的肿瘤“边缘”和“核心”特征，发现Epi1富集“边缘”特征，而Epi4、Epi5富集“核心”特征，提示Epi1这类细胞可能位于肿瘤侵袭前沿，与微环境相互作用更活跃。对上皮细胞进行更高分辨率聚类发现了更多亚群，基因集富集分析揭示了不同亚群特异富集的通路，如氧化应激、缺氧、转化生长因子-β(TGF-β)信号、Notch信号、翻译和胆固醇稳态等。
上皮细胞信号传导：细胞通讯分析显示，Epi1、Epi2、成纤维细胞(Fib1, Fib3)和血管内皮细胞是发出信号最多的细胞类型，而上皮细胞总体上接收的信号最多。Epi1和Epi2特异性地发出大量的细胞外基质(ECM)相关信号，如层粘连蛋白、纤连蛋白(FN1)、胶原蛋白和血小板反应蛋白(THBS)。在接收信号方面，Epi1和Epi2也显著富集接收多种生长因子和细胞因子信号，包括血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)和TGF-β信号。
成纤维细胞区室的细化：对三个成纤维细胞簇(Fib1, Fib2, Fib3)进行高分辨率聚类，识别出十个亚簇。通过标记基因和与已发表特征的比对，研究人员澄清了文献中常被混淆的两种免疫型癌症相关成纤维细胞(iCAF)：一种高表达补体和白细胞介素(IL)信号基因（如C3、IL6），可称为“炎症性iCAF”；另一种高表达基质细胞衍生因子-1(CXCL12)和脂质代谢基因，可称为“CXCL12+iCAF”。此外，还发现了高表达I型胶原蛋白(COL1A1)的肌成纤维细胞样CAF(myCAF)，以及高表达CXCL8和基质金属蛋白酶(MMP)的“CXCL8+MMP+” CAF。细胞通讯分析揭示，CXCL8+MMP+CAF与血管内皮细胞之间存在强烈的特异性相互作用，主要通过CXCL8-CXCR1/2配体-受体对介导，提示其在血管生成或血管共择中可能发挥作用。
细胞类型比例与性别的关联：利用sccomp模型分析发现，在整合的图谱水平，男性和女性患者在免疫区室和非免疫区室的细胞类型比例上无显著差异。然而，在单个数据集内部的分析中，发现了数据集特异性的性别相关差异，提示性别对肿瘤微环境的影响可能受到队列特异性因素（如解剖部位、风险因素）的调节，或需要更大的样本量才能检测到稳健的跨数据集信号。
研究结论与意义：本研究成功构建并深入分析了一个高分辨率的HPV阴性HNSCC整合单细胞图谱。该图谱不仅系统描绘了肿瘤微环境中复杂的细胞组成，还取得了多项新颖发现：解析了髓系区室，发现了一个之前未充分探索的IL1B+炎症性髓系亚群；澄清了两种经常被混淆的免疫型癌症相关成纤维细胞(iCAF)亚型；揭示了最具可塑性、富集pEMT程序的上皮细胞(Epi1)倾向于位于肿瘤边缘并与基质细胞密切互作；发现了CXCL8+成纤维细胞与血管内皮细胞之间的独特相互作用网络；并利用大样本量的优势，评估了细胞特征与临床分期、性别等表型的关联。更重要的是，该研究展示了此整合图谱的四大应用价值：情境化——将已有研究中的细胞群体置于统一的分类框架下，明确其相互关系；标准化——为不同研究中的相同细胞类型提供一致的命名；识别与表征——利用大数据量发现新的细胞亚群和互作；临床关联——增强识别分子特征与临床表型间统计学关联的能力。总之，该图谱作为一个强大的公共资源，为领域内后续研究提供了宝贵的参考框架，有助于生成和验证新假设，并最终推动针对HPV阴性HNSCC这一难治性疾病的、基于肿瘤微环境特性的精准治疗策略的开发。
