《Journal of Inherited Metabolic Disease》：Signal Peptide Engineering and Codon Optimization to Enhance α-Gal A Activity for rAAV Gene Therapy of Fabry Disease
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本研究针对法布里病（Fabry disease）基因治疗的瓶颈，通过信号肽（Signal Peptide）工程筛选出高效分泌肽sp21，并结合密码子优化（Codon Optimization）技术构建了hGLAco基因。将二者整合入rAAV8载体后，在小鼠模型中实现了α-半乳糖苷酶A（α-Gal A）活性最高提升6.9倍，并有效清除了血浆及关键组织中的毒性底物Lyso-Gb3，为开发更高效、持久的rAAV基因疗法提供了新策略。
引言：法布里病与基因治疗新策略
法布里病（Fabry disease）是一种X连锁隐性遗传的溶酶体贮积症，由编码α-半乳糖苷酶A（α-Gal A）的GLA基因突变引起。这导致其底物globotriaosylceramide（Gb3）及其脱酰衍生物globotriaosylsphingosine（Lyso-Gb3）在多器官中病理性堆积，进而引发进行性的心、肾和脑血管功能障碍。当前主要的酶替代疗法（Enzyme Replacement Therapy, ERT）存在半衰期短、需频繁静脉注射、可能产生中和抗体等局限性。因此，开发更有效、持久的治疗策略迫在眉睫。重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus, rAAV）介导的基因治疗因其安全性和长期有效性成为有前景的方向。然而，提高治疗效率、降低载体使用剂量以规避高剂量带来的安全风险是关键挑战。本研究聚焦于通过工程化改造信号肽和进行密码子优化，旨在增强α-Gal A的表达与分泌，从而提升rAAV基因疗法对法布里病的疗效。
结果
1. 体外筛选增强α-Gal A分泌的信号肽
为增强α-Gal A的分泌，研究将人GLA基因的天然信号肽替换为22种异源信号肽。在人工肝癌HepG2细胞中进行瞬时转染筛选发现，其中五种信号肽（sp1, sp4, sp20, sp21, sp22）能提高培养基中的α-Gal A活性，其中sp21效果最为显著，使酶活性达到野生型信号肽的2.3倍。蛋白质印迹分析进一步证实，这五种修饰后的GLA基因在培养基中的表达和分泌均有所增加，与酶活性的提升一致。
2. 体内验证选定信号肽增强α-Gal A过表达的能力
选择效果最佳的sp21进行体内验证。研究人员构建了携带野生型信号肽（wtsp）或sp21驱动的人GLA基因的rAAV8载体，并使用肝脏特异性启动子（LSP）。将载体以不同剂量静脉注射给法布里病模型小鼠（GlaKO）。结果表明，无论是载体基因组DNA还是mRNA拷贝数，均呈剂量依赖性增加。注射后12周，ssAAV8.sp21-hGLA处理组小鼠血浆中的α-Gal A活性显著高于野生型信号肽组，在低、中、高剂量下分别提高了28.0倍、15.7倍和38.7倍。肝脏中的酶活性也观察到类似的显著提升。免疫组化分析证实，高剂量ssAAV8.sp21-hGLA组在心脏、肾脏等外周组织中的α-Gal A表达更高。此外，分泌的α-Gal A保持了完整的糖基化位点，与重组人α-Gal A一致。最重要的是，血浆中法布里病的关键生物标志物Lyso-Gb3水平在所有治疗组均显著降低，且ssAAV8.sp21-hGLA组的降低效果更优，并呈现剂量依赖性。
3. 人GLA基因的密码子优化
为进一步提升α-Gal A表达，研究对人GLAcDNA进行了密码子优化，得到hGLAco。优化策略包括使用哺乳细胞常用密码子、移除所有CpG岛以降低体内基因沉默风险、调整GC含量至0.59、消除潜在的可变剪接位点，并将密码子适应指数（CAI）提高至0.95。在HepG2细胞中的体外实验表明，与野生型hGLA相比，hGLAco使细胞裂解液中的α-Gal A蛋白表达增加了1.4倍，并使培养基中的酶活性提升了约4倍。免疫荧光染色也证实了hGLAco转染细胞中α-Gal A表达增强。
4. 联合使用工程化信号肽与密码子优化基因的rAAV基因治疗
为最大化α-Gal A表达，研究将信号肽sp21与密码子优化基因hGLAco结合，构建了四种自互补型rAAV8（scAAV8）载体。以中等剂量注射法布里病小鼠后8周，scAAV8.sp21-hGLAco组表现出最高的血浆α-Gal A活性（3069.9 nmol/h/mL），分别是scAAV8.wtsp-hGLA组和scAAV8.sp21-hGLA组的6.9倍和2.0倍。这表明密码子优化和信号肽工程在体内均能有效增强酶活性，且两者具有协同效应。注射后14周，在所有治疗组小鼠的肝脏、心脏、肾脏和脾脏中均检测到α-Gal A活性显著增加，其中scAAV8.sp21-hGLAco组在各组织的酶活性提升最为显著。免疫组化结果与酶活性分析一致。同时，所有治疗组小鼠血浆和关键组织（肝、肾、心）中的Lyso-Gb3积累被有效清除，大部分组别降至未治疗法布里病小鼠水平的5%以下，其中scAAV8.sp21-hGLAco组的清除效果最优。组织学评估未发现肝脏有炎症或损伤迹象，提示在该剂量下载体具有良好安全性。
5. 肝细胞产生的α-Gal A通过M6PR途径被肾细胞摄取
为探究肝细胞表达的α-Gal A如何被外周组织利用，研究利用CRISPR/Cas9技术构建了人GLA基因敲除（KO）的293T细胞（肾源细胞系）。将转染了hGLAco的HepG2细胞的条件培养基与GLAKO 293T细胞共培养，发现KO细胞内的α-Gal A活性和表达显著增加。而当在培养基中加入甘露糖-6-磷酸（Mannose-6-phosphate, M6P）竞争性抑制时，α-Gal A的摄取被显著阻断。这证实了肝细胞分泌的、经过密码子优化的α-Gal A，是通过阳离子非依赖性的甘露糖-6-磷酸受体（CI-M6PR）途径被肾源细胞有效内吞的，这解释了疗法能够实现“交叉校正”清除外周组织底物的机制。
讨论
本研究证明，通过信号肽工程（特别是使用sp21）和密码子优化（hGLAco）策略，可以显著增强rAAV载体在肝脏中表达和分泌的α-Gal A的活性。联合两种策略的scAAV8.sp21-hGLAco载体，在法布里病小鼠模型中实现了远超野生型基因的酶活性提升（6.9倍）和高效持久的Lyso-Gb3清除，且未观察到明显肝毒性。这为降低临床治疗所需rAAV载体剂量、提高安全性和疗效提供了强有力的临床前证据。优化后的α-Gal A可被外周组织通过M6PR途径有效摄取，实现了治疗酶的器官间递送。尽管研究存在诸如小鼠模型不能完全模拟人类疾病所有病理特征、部分组别Lyso-Gb3水平过低难以精确比较等局限，但其核心发现为开发新一代高效、低剂量的法布里病rAAV基因疗法奠定了坚实基础。目前，基于此hGLAco与工程化信号肽的相关AAV治疗策略已进入临床试验阶段。
