《Journal of Integrative Plant Biology》：HSP101-encoding NEO-TETRAPLOID RICE FERTILITY GENE 1 regulates tapetum development through interaction with SAPK2 in polyploid rice
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本文揭示了热激蛋白基因HSP101的一种新型等位变异体——新四倍体水稻育性基因1（NTRF1），在多倍体水稻育性调控中的关键作用。研究发现，NTRF1通过与脱落酸（ABA）信号通路核心激酶SAPK2直接互作，协调活性氧（ROS）稳态，从而精准调控绒毡层程序性细胞死亡（PCD）进程，保障花粉正常发育与成熟。该研究为深入理解多倍体水稻育性调控网络及分子育种改良提供了重要靶点。
HSP101编码的新四倍体水稻育性基因NTRF1通过与SAPK2互作调控多倍体水稻的育性
摘要
新四倍体水稻（NTR）中鉴定出的热激蛋白101（HSP101）新等位变异体——新四倍体水稻育性基因1（NTRF1），被证明是调控NTR育性的关键因子，但其具体调控机制尚不清晰。本研究通过鉴定ntrf1突变体，发现其结实率显著降低源于花粉发育缺陷。机制上，NTRF1功能的缺失破坏了花药中活性氧（ROS）的稳态，从而延迟了绒毡层细胞的程序性细胞死亡（PCD）进程。突变体花药的RNA-seq分析显示，脱落酸（ABA）信号组分（OsPP2C49， OsbZIP23）和ROS相关基因（OsRBOH1， OsRBOH8）的表达失调，同时关键的绒毡层发育调控因子（OsGAmyb， CYP703A3）显著下调。整合多组学分析表明，ntrf1突变体中降低的花粉活力与丙酮酸代谢途径相关。蛋白互作实验证实，NTRF1直接与ABA信号转导的核心激酶SAPK2结合。这一互作解释了外源施加ABA能够部分恢复ntrf1突变体结实率降低的现象。综上，本研究阐明了以NTRF1为中心的调控网络，该网络通过协调ABA信号与ROS稳态，以确保绒毡层PCD的适时发生及随后的花粉成熟，为推进多倍体水稻的遗传改良提供了有价值的分子靶点。
引言
水稻是世界最重要的粮食作物之一。多倍化是驱动被子植物多样化的关键进化机制，多倍体植物具有生长健壮、胁迫耐受性增强、果实更大、营养成分更优和杂种优势强等优点，是一种有前景的育种策略。同源四倍体水稻（ATR）是一种有用的种质资源，但低育性是其在研究和应用中面临的重大挑战。自21世纪以来，中国在解析ATR低育性遗传基础方面取得了实质性进展，成功培育了高育性四倍体品种，如多倍体减数分裂稳定水稻（PMeS）和新四倍体水稻（NTR）。其中，华多1号和华多2号两个NTR品系于2016年获得国家植物新品种权。这些突破有效克服了ATR长期以来的育性难题。
为阐明NTR高育性的遗传机制，前期研究通过比较基因组分析，成功鉴定出HSP101的一个新等位变异体，命名为NTRF1，是调控NTR育性的关键因子。NTRF1在其第一个外显子的第七个核苷酸位置有一个特定的C-to-G单核苷酸多态性（SNP），并在正常条件下于减数分裂期间的花药组织中特异性表达。热激蛋白是胁迫响应的核心组分，其中HSP101作为HSP100/ClpB家族成员，是耐热性的关键响应因子。越来越多的证据表明HSP101在植物发育中扮演额外角色。在拟南芥中，HSP101调控开花时间；在水稻中，FLO24（编码HSP101）影响淀粉生物合成和胚乳发育；玉米ZmHSP101参与减数分裂DNA双链断裂修复，表明HSP101在植物生殖功能中的保守性。
近期研究揭示了HSPs与ROS之间的联系，以及ROS产生与ABA信号通路之间的紧密联系。在水稻花药发育过程中，SAPK2介导的ROS稳态对于正常的PCD至关重要，而PCD是花粉发育的关键组成部分。尽管HSPs和ABA信号都能独立调控ROS，但它们在绒毡层PCD中的潜在串扰尚未被探索。基于前期研究初步确定NTRF1在调控NTR育性中起关键作用，本研究系统研究了NTRF1调控NTR育性的分子机制。
ntrf1突变体在新四倍体水稻（NTR）中表现出低结实率
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在华多1号（H1）背景中创建的ntrf1突变体，经鉴定获得两个无T-DNA的纯合移码突变体（ntrf1-1和ntrf1-2）。表型分析证实，ntrf1突变体在单株穗数、穗长和株高上与野生型H1无显著差异，但其结实率（36.99%和38.92%）显著低于H1（78.10%）。将NTRF1基因组片段导入ntrf1-1突变体构建的功能互补株系（ntrf1com）的结实率（66.30%）得到显著恢复，表明NTRF1在正常条件下对调控NTR育性起关键作用。
由于在NTRF1中发现了一个特定的SNP变异，研究比较了NTR（H1）和二倍体水稻（台中65，T65）在正常条件下减数分裂花药中NTRF1和HSP101的转录本。有趣的是，从H1 cDNA中扩增NTRF1的编码序列（CDS）产生了两种转录本：一种完全剪接（2739 bp），另一种保留所有内含子（3106 bp）。相比之下，HSP101转录本在正常条件下的二倍体水稻中无法检测到，仅在热激处理后能扩增出2739 bp的转录本。此外，由于SNP导致的非同义突变，AlphaFold2预测的蛋白三级结构显示，NTRF1中因突变在第三个丙氨酸（Ala）和甲硫氨酸（Met）残基之间形成了新的氢键，该SNP也改变了限制性内切酶识别位点。
为了探究敲除位于NTRF1相同基因组位点的HSP101基因是否影响二倍体水稻在正常条件下的结实率，研究在二倍体水稻台中65（T65）和黄华占（HHZ）背景中利用CRISPR/Cas9系统敲除了HSP101。结果表明，在两种遗传背景的二倍体水稻中，突变体与野生型的结实率均无显著差异。基于以上结果，研究者认为HSP101在正常条件下可能不是调控二倍体水稻育性所必需的，而NTR中特异的SNP变异可能是导致NTRF1基因新功能化的重要原因之一。
NTRF1突变降低新四倍体水稻（NTR）的花粉活力
为探究ntrf1结实率降低的原因，对H1和ntrf1突变体进行了系统比较分析。全透明苯胺蓝染色共聚焦激光扫描显微镜（WE-CLSM）分析证实，ntrf1的胚囊育性（89.41%和87.45%）与H1（89.82%）无显著差异。在花药发育第7、8、13期（S7， S8， S13），ntrf1的花粉形态也未观察到显著异常。I2-KI染色显示ntrf1突变体（86.34%和91.22%）与H1（94.98%）的花粉染色率无显著差异。
然而，开花后30分钟，通过氢氧化钠透明技术测定的ntrf1突变体的花粉萌发率（27.97%和26.18%）显著低于H1（89.69%）。此外，用1% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液染色评估花粉活力显示，H1中78.39%的花粉呈深红色（高活力），仅5.93%呈灰色（无活力）。相比之下，ntrf1花粉活力显著降低，仅24.56%和20.78%的颗粒被染成深红色，而无活力花粉分别占62.77%和53.33%。对NTRF1/ntrf1F1代植株的TTC染色显示，其花粉活力（45.20%）介于H1和ntrf1突变体之间，表明NTRF1可能以配子体方式发挥作用。同时，ntrf1com株系的花粉活力显著恢复至60.36%。这些结果表明，花粉活力受损是ntrf1突变体结实率降低的主要原因。
NTRF1影响新四倍体水稻（NTR）的花粉淀粉合成和线粒体发育
由于NTRF1敲除导致花粉活力降低，研究对ntrf1-1突变体成熟花粉的结构特征进行了分析。高碘酸-希夫（PAS）染色显示，H1花粉中的淀粉颗粒呈现典型的紧密排列。透射电子显微镜（TEM）观察表明，H1花粉粒形态清晰，淀粉粒发育完全完整。外壁外层轮廓光滑，柱状层厚度均匀，外壁-内壁界面清晰可辨。此外，结构清晰的球形线粒体在H1花粉内大量分布。
相比之下，ntrf1-1花粉的组织结构更松散，淀粉积累显著减少。ntrf1-1突变体表现出淀粉粒发育不全，大部分呈新月形。花粉外壁内层与内壁之间的边界模糊，柱状层厚度不均。此外，线粒体结构模糊，完整性受损。扫描电子显微镜（SEM）进一步证实，ntrf1-1花粉粒体积略小于H1。通过ImageJ软件量化花粉粒半径并计算体积，验证了ntrf1-1突变体的花粉粒体积（40995.32 μm3）相比H1（44737.16 μm3）显著减小。
NTRF1是新四倍体水稻（NTR）绒毡层程序性细胞死亡（PCD）所必需的
为探究ntrf1突变体花粉败育的细胞学机制，检查了H1和ntrf1-1突变体的花药半薄切片。在H1花药中，从S7到S8b期（S7， S8a， S8b），花粉母细胞（PMCs）沿绒毡层呈圆形排列。同时，绒毡层细胞发生液泡化并表现出典型的PCD特征。到第9期（S9），其降解持续伴随着细胞质浓缩。在S10-S11期，绒毡层降解为细胞碎片，液泡化的小孢子进行第一次有丝分裂。随后，绒毡层在S12-S13期完全消失。相比之下，ntrf1-1突变体从S7到S8b期的绒毡层细胞含有丰富的细胞质，没有明显的液泡化，表明PCD启动延迟。ntrf1-1突变体的绒毡层在S9期开始液泡化，在S10-S11期染色比H1更深，在S12-S13期几乎完全消失。
为阐明ntrf1-1中绒毡层降解延迟的机制，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法监测S7至S13期的PCD进程。在H1中，凋亡信号在S8-S10期在绒毡层中被检测到，而ntrf1-1突变体中的凋亡信号延迟到S9期才出现。在S11至S13期，H1和ntrf1-1突变体中均未观察到凋亡信号。
TEM分析证实，在S6期，H1和ntrf1-1突变体的花药结构无显著差异。在S7期，H1和ntrf1-1突变体的PMCs都开始接近绒毡层。此时，在H1的绒毡层细胞核周围观察到许多小囊泡，同时在周边区域形成大液泡。大多数细胞器严重降解，细胞质浓缩。相反，ntrf1-1突变体的绒毡层细胞排列紧密，含有可见的细胞器，如线粒体和高尔基体，核膜完整。综上所述，这些发现证明NTRF1是绒毡层PCD的重要调节因子，其功能缺失延迟了PCD的启动。
NTRF1影响ROS和ABA相关基因的表达
对ntrf1-1突变体和H1在四个发育阶段（S7， S8， S9， S11）的花药组织进行了RNA-seq分析。差异表达基因（DEGs）分析在各阶段分别鉴定出上调基因473、4952、1473、1567个，下调基因1095、2871、1510、1743个。
鉴于绒毡层PCD的启动与ROS积累密切相关，研究特别分析了S7至S9期与ROS代谢相关的DEGs。结果显示，在S7和S8期，ROS生成基因在ntrf1-1中下调。NADPH氧化酶基因的下调尤为显著：S7期的OsRBOH8和OsRBOH9；S8期的OsRBOH1， OsRBOH2， OsRBOH4和OsRBOH6。相反，ROS清除基因OsMT2b在S8期上调。其他ROS生成基因，如OsUGT3， OsFAH1和OsCYP2也表现出下调。由于ROS生成由ABA信号诱导，检查了与ABA生物合成和信号转导相关的基因，发现它们也下调，包括OsSAPK6， OsbZIP23， OsPP2C49， OsNCED3和OsbZIP72。
然而，在S9期，观察到ROS和ABA相关基因的表达趋势相反。ROS生成基因（OsFAH2， OsRBOH1， OsRBOH4， CDPK5）和ABA信号/生物合成基因（OsPP2C49， OsbZIP72， SAPK2， OsNCED3）显著上调。随后，RT-qPCR验证了ABA和ROS相关基因的差异表达，证实了RNA-seq数据的可靠性。这些结果表明，ntrf1突变体中延迟的绒毡层PCD可能受ABA和ROS信号分子的调控。
NTRF1影响花粉发育相关基因的表达
为阐明NTRF1在花粉发育中的作用，分析了DEGs中与花药发育相关的基因。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，下调的DEGs富集在对花粉发育至关重要的代谢途径中，包括脂肪酸生物合成、角质/木栓质/蜡质生物合成以及淀粉和蔗糖代谢。此外，在S7至S9期下调的DEGs中，鉴定出多个参与花粉发育的基因。这些基因包括绒毡层发育基因（OsGAmyb， OsMYB80， OsAP25， OsRR24， OsC4， OsEDM2L）、花粉壁发育基因（OsNP1， OsPKS1， CYP703A3， CYP704B2， OsACOS12）以及与花粉内营养合成相关的基因（OspPGM， OsSPS1， OsAPL4）。随后的RT-qPCR分析进一步验证了RNA-seq结果的可靠性。
为探究花粉活力在发育晚期下降的代谢基础，对S12期花药进行了非靶向代谢组学分析。共鉴定出287种代谢物。根据P<0.05和变量重要性投影（VIP）>1的标准，鉴定出93种差异积累代谢物，其中64种上调，29种下调。为探索H1和ntrf1-1突变体花粉发育晚期基因表达变化与差异代谢物积累之间的相关性，对S11期转录组和S12期代谢组数据集进行了整合分析。该分析显示，丙酮酸代谢途径（osa00620）在两个数据集的KEGG通路中均显著富集（P<0.01）。鉴于丙酮酸代谢与ATP生成之间的既定联系，研究观察到乙酰辅酶A（糖酵解和三羧酸循环的关键中间体）显著减少。同时，LOC_Os03g18220（Ospdc2，编码丙酮酸脱羧酶）的表达下调。这些结果表明，NTRF1突变影响了关键花粉发育基因的表达，并破坏了花粉能量代谢，导致花粉活力降低。
NTRF1与ABA信号正调控因子SAPK2互作
为阐明NTRF1影响花粉发育的潜在机制，进行了酵母双杂交（Y2H）实验以鉴定互作蛋白。结果表明，NTRF1在体外与胁迫激活蛋白激酶2（SAPK2）互作。由于SAPK2是已知的ABA信号正调控因子，研究重点关注SAPK2进行进一步研究。亚细胞定位分析证实，NTRF1定位于细胞质，而SAPK2定位于细胞质和细胞核。双分子荧光互补（BiFC）实验证实了NTRF1与SAPK2的互作。NTRF1-cYFP和SAPK2-nYFP的荧光信号主要定位于细胞质，与其细胞质定位一致。为进一步证实它们的互作，在本氏烟草中进行了萤光素酶互补成像（LCI）和免疫共沉淀（Co-IP）实验，这些实验证实了NTRF1与SAPK2的互作。以上结果表明，NTRF1在体外和体内均与SAPK2发生物理互作。RT-qPCR分析显示，NTRF1和SAPK2在早期花药组织中的表达模式高度相似，转录水平在S7期达到峰值，表明存在潜在的共调控或功能合作。
外源施加ABA部分恢复ntrf1突变体的育性**
ABA通过调节ROS水平和诱导绒毡层细胞PCD，在调控花粉活力中起关键作用。为探究ROS动态紊乱是否导致ntrf1突变体观察到的花药发育缺陷，首先对花药进行了氮蓝四唑（NBT）染色。结果显示，在S7至S9期，ROS在H1花药中显著积累，而在ntrf1-1花药中ROS积累明显减少。这一结果通过荧光探针2‘，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCF-DA）得到进一步验证。在S7至S9期，在H1花药中检测到明显的ROS信号，而ntrf1-1在S7至S8期的信号几乎检测不到。荧光强度的定量分析证实，在S7至S9期，H1花药中的ROS水平显著高于ntrf1-1。与此一致，对减数分裂期花药内源ABA水平的定量分析证实，ntrf1-1突变体（11.99 ng/g）相比H1（14.47 ng/g）显著降低。
此外，在孕穗期用100 μM ABA处理，S8期花药的ROS水平在H1中未发生显著变化，但在ntrf1-1中导致显著增加。更重要的是，外源ABA处理挽救了在ntrf1-1突变体中观察到的生殖发育缺陷。统计分析表明，ABA处理将败育花粉比例从62.78%降至37.03%（H1为11.80%，ABA处理的H1为18.08%），并将结实率从37.38%提高至59.71%（H1为79.32%）。ABA处理的H1结实率为68.59%，略低于未处理的H1。综上所述，这些发现证明NTRF1介导的ROS稳态调控对于正常花粉发育至关重要。
讨论
NTRF1对新四倍体水稻（NTR）的花粉发育至关重要
NTR是可用于水稻多倍体育种的新型优良种质，并已利用该种质培育出一些高产的多倍体杂交水稻。本研究确定了HSP101等位变异体NTRF1在NTR花粉发育中的关键作用。NTRF1突变显著降低了结实率，这是由低花粉活力引起的。细胞学研究表明，受损的花粉活力可能是由于ntrf1突变体中绒毡层PCD延迟所致。ntrf1突变体成熟花粉的淀粉粒和线粒体形态异常。此外，ntrf1突变体还表现出丙酮酸代谢紊乱。鉴于丙酮酸通过TCA循环在ATP生成中的作用，这些扰动可能导致能量缺陷，从而影响花粉萌发。这些结果表明NTRF1在绒毡层PCD中起关键作用。PCD进程延迟破坏了对小孢子发育的营养支持，导致花粉活力降低和萌发受损。
在本研究中，还发现NTRF1突变会影响绒毡层基因的表达，如OsGAmyb， CYP703A3和OsABCG26。这些基因已被发现在花粉发育中起重要作用。OsGAmyb是一个在花药绒毡层细胞中具有高表达特异性的转录因子，在绒毡层降解调节因子TDR的上游发挥作用。CYP703A3是一种细胞色素P450羟化酶，对外壁形成至关重要。OsABCG26是ABC转运蛋白家族的成员，主要参与绒毡层细胞内脂质分子的运输。同时，淀粉和蔗糖合成基因OsGBSSI，
