肿瘤抑癌基因PTEN缺失驱动肿瘤发生的新机制：PTEN作为蛋白酪氨酸磷酸酶去磷酸化PI3KβY962调控PI3Kβ–EPHA2复合体信号，揭示p-PI3KβY962为新的成药靶点与生物标志物

《Cancer Discovery》：PTEN acts as a protein tyrosine phosphatase regulating PI3Kβ–EPHA2 interact... Open Access

本文聚焦于PTEN缺失肿瘤的“不可成药”困境，揭示了一种超越传统PI3Kβ激酶活性的新机制。研究发现，PTEN作为一种蛋白酪氨酸磷酸酶，能去磷酸化PI3Kβ的酪氨酸962位点（p-PI3KβY962）。PTEN缺失导致p-PI3KβY962水平升高，驱动其与EPHA2和SRC形成三元复合物，进而激活致癌性的pERK/c-MYC和pAKT通路。该研究不仅开发了p-PI3KβY962特异性抗体作为潜在的临床生物标志物，还发现FDA已批准的SRC/EPHA2抑制剂达沙替尼可有效抑制p-PI3KβY962并阻断PTEN缺失肿瘤的生长。这为开发靶向p-PI3KβY962的疗法和开展达沙替尼的“老药新用”临床试验指明了新方向。

　　

BioID蛋白质相互作用谱分析揭示PTEN缺失诱导PI3Kβ–EPHA2相互作用

为了探究PTEN缺失背景下PI3Kα和/或PI3Kβ是否形成新的相互作用，研究者在PTEN缺失的乳腺癌细胞系中进行了BioID邻近标记分析。通过对比PI3Kα和PI3Kβ的互作组，研究者发现这两种亚型在PTEN缺失的三阴性乳腺癌（TNBC）细胞中具有明显不同的相互作用网络，重叠度仅约30%。值得注意的是，在BT549和MDA-MB-468细胞中，EPHA2是唯一与PI3Kβ特异性相关且在质膜上共定位的相互作用蛋白。随后的免疫共沉淀实验进一步证实，在PTEN缺失的BT549和HCC70细胞中，内源性EPHA2与PI3Kβ（而非PI3Kα）存在相互作用。有趣的是，在PTEN野生型细胞中，EPHA2与PI3Kα和PI3Kβ的相互作用程度相当，但在PTEN敲除细胞中，EPHA2与PI3Kβ的相互作用显著增强，与PI3Kα的相互作用则减弱。反之，在PTEN缺失的BT549细胞中恢复PTEN表达，则能显著削弱EPHA2与PI3Kβ的相互作用。这些结果共同表明，PTEN的缺失会特异性促进EPHA2与PI3Kβ之间更强的结合。

PTEN作为蛋白酪氨酸磷酸酶通过去磷酸化PI3Kβ酪氨酸-962位点调控PI3Kβ–EPHA2相互作用

研究进一步探究了PTEN缺失增强PI3Kβ–EPHA2相互作用的机制。除了其众所周知的脂质磷酸酶活性，PTEN还具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性。研究者发现，在PTEN敲除的HEK293T细胞中，免疫沉淀的PI3Kβ（而非PI3Kα）的酪氨酸磷酸化水平显著升高。通过在PTEN缺失的BT549和HCC70细胞中稳定表达PTEN野生型或其功能缺失突变体（脂质磷酸酶活性缺陷的G129E、蛋白磷酸酶活性缺陷的Y138L、或双缺陷的C124S），实验证实，重新表达PTEN野生型或G129E突变体可显著降低PI3Kβ的酪氨酸磷酸化水平，而C124S或Y138L突变体则无此效果，说明PTEN通过其蛋白磷酸酶活性调控PI3Kβ的酪氨酸磷酸化。同时，底物捕获突变体PTEN-C124S与PI3Kβ的结合显著强于PTEN野生型，支持了PI3Kβ是PTEN的生理性底物。此外，表达PTEN野生型或G129E突变体能显著减弱PTEN缺失细胞中PI3Kβ与EPHA2的相互作用，而Y138L或C124S突变体则不能，表明PTEN作为蛋白磷酸酶通过调节PI3Kβ的磷酸化状态来调控其与EPHA2的互作。

为了找出PTEN调控的PI3Kβ具体磷酸化位点，研究者对来自PTEN敲除HEK293T细胞的Flag标记PI3Kβ进行了LC-MS/MS分析，检测到PI3Kβ在酪氨酸962位点和苏氨酸930位点的磷酸化。无细胞去磷酸化实验显示，PTEN野生型和G129E突变体（保留蛋白磷酸酶功能）能有效去磷酸化含有p-PI3Kβ^Y962的合成肽段，而蛋白磷酸酶缺陷的突变体Y138L和C124S则不能。值得注意的是，所有PTEN变体都无法去磷酸化含有pT930的肽段，表明PTEN是一种靶向PI3Kβ Y962位点的酪氨酸磷酸酶。

接下来，研究者利用模拟非磷酸化状态（T930A, Y962F, T930A/Y962F）或模拟磷酸化状态（T930E, Y962E, T930E/Y962E）的PI3Kβ突变体，探究这些位点的磷酸化如何影响PI3Kβ–EPHA2相互作用。在PTEN缺失的BT549细胞中，Y962F和T930A/Y962F突变体显著削弱了PI3Kβ与EPHA2的相互作用，而T930A突变体则无此影响。相反，在PTEN野生型的MDA-MB-231细胞中，表达磷酸化模拟突变体T930E或T930E/Y962E增强了PI3Kβ与EPHA2的相互作用。免疫荧光染色也证实，模拟磷酸化的PI3Kβ-Y962E突变体主要定位于质膜并与EPHA2共定位，而模拟非磷酸化的Y962F突变体则主要在胞质中。这些结果表明，PI3Kβ Y962位点的磷酸化增强了其与EPHA2的相互作用，并促进PI3Kβ在PTEN缺失细胞中的膜定位。总之，PTEN通过调控PI3Kβ Y962位点的磷酸化来控制PI3Kβ–EPHA2相互作用，PTEN缺失则通过允许PI3Kβ-Y962的持续性磷酸化来促进这种互作。

持续的PI3Kβ磷酸化支持PTEN缺失肿瘤的生长

为评估PTEN缺失诱导的PI3Kβ酪氨酸磷酸化在肿瘤发生中的功能重要性，研究者探究了磷酸化缺陷的PI3Kβ突变体能否模拟PI3Kβ基因敲除，从而抑制PTEN缺失肿瘤的生长。他们利用来源于同时缺失Pten和Trp53并敲除Pik3cb的乳腺癌基因工程小鼠模型的PPB原代肿瘤细胞，重建表达小鼠PI3Kβ野生型或磷酸化缺陷突变体。结果显示，与人类PTEN缺失癌细胞中的观察一致，添加回Y956F突变体（对应人类Y962F）或T924A/Y956F双突变体会减少PI3Kβ与EPHA2的结合。在体内，将工程化的PPB肿瘤细胞移植到小鼠乳腺脂肪垫中，PI3Kβ野生型恢复了PPB细胞的成瘤能力，而Y956F和T924A/Y956F突变体恢复肿瘤生长的能力显著减弱，并伴随Ki67染色的减少。类似地，在PTEN缺失的前列腺癌细胞PC3模型中，敲低内源性PI3Kβ后，过表达PI3Kβ野生型可促进肿瘤强劲生长，而非磷酸化的Y962F和T930A/Y962F突变体则显著削弱了这一促瘤效应，并降低了Ki67水平。这些数据表明，PI3Kβ的酪氨酸磷酸化在多种PTEN缺失的癌症模型中驱动肿瘤发生至关重要。

PI3Kβ-Y962磷酸化水平升高与乳腺癌和前列腺癌患者中的PTEN缺失密切相关

为了进一步评估PTEN介导的PI3Kβ^Y962磷酸化，研究者开发了一种可特异性识别人PI3Kβ Y962磷酸化位点（p-PI3Kβ^Y962）的多克隆抗体。该抗体在多种细胞系中可特异性检测过表达及内源性的p-PI3Kβ^Y962。在PTEN缺失的BT549细胞中过表达PTEN，或在PTEN野生型的MDA-MB-157细胞中敲除PTEN，分别显著降低了或增强了p-PI3Kβ^Y962水平，表明p-PI3Kβ^Y962受PTEN的紧密调控。

利用该特异性抗体，研究者在两组独立的人类癌症患者队列中分析了PTEN缺失与p-PI3Kβ^Y962水平之间的关系。在对10例携带PTEN突变的TNBC患者和10例PTEN野生型对照患者的匹配队列进行多重免疫组化分析时发现，PTEN突变肿瘤中p-PI3Kβ^Y962水平显著高于PTEN野生型对照组。线性回归分析进一步显示，在该TNBC队列中，PTEN表达与p-PI3Kβ^Y962水平呈强负相关。此外，在PTEN缺失的肿瘤组织内，PTEN完好的癌巢间质细胞的p-PI3Kβ^Y962水平远低于PTEN突变的肿瘤细胞，强化了临床样本中PTEN缺失与p-PI3Kβ^Y962升高