《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Inhibitors of isocitrate lyase for weed suppression: Molecular modeling and biological evaluation
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通过构建拟南芥异柠檬酸酶三维模型并进行虚拟筛选，鉴定出itaconate和tartrate等潜在抑制剂。体外及体内实验表明itaconate对脂质含量高的物种抑制更显著，通过干扰糖异生抑制幼苗生长，但需高浓度才能杀灭杂草，提示需结构优化以提高 herbicidal efficacy。
保罗·维尼修斯·莫雷拉·达·科斯塔·梅内塞斯（Paulo Vinicius Moreira da Costa Menezes）| 伊莎贝拉·费雷拉·恩里克（Isabela Ferreira Henrique）| 拉里萨·阿尤米·卡吉哈拉（Larissa Ayumi Kajihara）| 加布里埃尔·费利佩·斯图普（Gabriel Felipe Stulp）| 埃里卡·瓦基达（Erika Wakida）| 伊莎贝拉·德·卡瓦略·孔特塞托（Isabela de Carvalho Contesoto）| 安娜·拉奎尔·帕帕·阿努西阿桑（Ana Raquel Papa Anuncia??o）| 安娜·卢伊扎·桑托斯·瓦格纳（Ana Luiza Santos Wagner）| 斯特凡妮·帕特尔·帕斯夸洛托（Stéphani Patel Pasqualotto）| 乔瓦娜·马里尼奥·埃尔南德斯（Giovana Marinho Hernandes）| 吉斯兰·克里斯蒂安娜·曼托瓦内利（Gislaine Cristiane Mantovanelli）| 拉斐尔·卡埃塔诺·达·席尔瓦（Rafael Caetano da Silva）| 哈利·凯谢塔·德·奥利维拉（Halley Caixeta de Oliveira）| 爱德华多·马基亚马·克洛索夫斯基（Eduardo Makiyama Klosowski）| 马西奥·希格阿基·米托（Marcio Shigueaki Mito）| 雷南·法尔西奥尼（Renan Falcioni）| 韦尔纳·卡马戈斯·安图内斯（Werner Camargos Antunes）| 罗德里戈·波利梅尼·康斯坦丁（Rodrigo Polimeni Constantin）| 罗杰里奥·马尔基奥西（Rogério Marchiosi）| 旺德莱·丹塔斯·多斯·桑托斯（Wanderley Dantas dos Santos）| 艾米·卢伊扎·伊希伊·伊瓦莫托（Emy Luiza Ishii Iwamoto）
生物化学系，生物氧化实验室，马林加州立大学，科伦坡大道5790号，马林加，PR 87020-900，巴西
摘要
异柠檬酸裂解酶（ICL）在早期幼苗发育过程中通过将脂肪酸转化为糖类来动员种子中的脂质储备，起着核心作用。在本研究中，构建了一个ICL的三维模型，通过虚拟筛选模拟来识别潜在的配体。进行了体外和体内实验，以评估选定的配体——异戊二酸和酒石酸——对不同种子脂质含量的作物和杂草物种发育的影响。在发芽箱中生长的5天大的幼苗（浓度为50–1000 μM）以及在温室条件下盆栽生长的14天大的幼苗（浓度为0.008–16.25 g/dm3）中评估了异戊二酸的效果。总体而言，种子脂质含量较高的物种对异戊二酸的抑制作用更为敏感，尤其是在幼苗生长初期。从敏感物种中提取的ICL活性被异戊二酸抑制，而酒石酸则没有这种效果。由于异戊二酸主要作用于乙二酸循环，它抑制了Euphorbia heterophylla幼苗子叶中的糖异生作用，减少了向根部的糖分输送，从而抑制了幼苗的发育。然而，在温室条件下实现杂草死亡所需的浓度非常高，表明异戊二酸的除草效果有限。通过结构修饰异戊二酸以增强其与ICL催化残基的相互作用或改善细胞吸收，可能会产生更有效的除草剂候选物。本研究开发的ArThaICL对接模型提供的详细蛋白质-配体相互作用数据为这一优化过程提供了有价值的工具。
引言
目前，杂草管理面临的一个主要挑战是存在对传统除草剂具有抗性的杂草生物型，包括那些用于转基因作物中的除草剂，如草甘膦（Baek等人，2021；Westwood等人，2018）。此外，人们越来越关注合成除草剂对环境和动植物健康的有害影响（Gupta，2018；Hasenbein等人，2017；Heap，2014；Rose等人，2016）。这促使人们大力研究具有不同作用机制（MOA）的天然物质（Westwood等人，2018），这些物质能够精确控制特定的杂草物种，同时对动物和人类的毒性较低（Fujii，2001；Hiradate等人，2010）。
针对种子萌发和萌发后生长过程中参与储存营养物动员的蛋白质进行靶向研究，是一种值得探索的新除草剂作用机制。种子主要储存脂质、碳水化合物和蛋白质，其储存的比例和器官因物种而异。在许多种子中，主要的储备物质是脂质，例如蓖麻（Ricinus communis）、花生（Arachis hypogaea）、向日葵（Helianthus annuus）、油菜（Brassica napus）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）（Salunkhe，1992）。在这些油料种子中，脂肪酸的β-氧化后经过乙二酸循环和柠檬酸循环反应，将脂肪酸中的碳转化为含有三个或更多碳原子的碳骨架，这些碳骨架可以作为葡萄糖生物合成的前体（Graham，2008）。在低脂质种子中，如谷物，乙二酸循环不仅对于将脂肪酸转化为碳水化合物至关重要，还对胚乳酸化和氨基酸合成起着关键作用（Ma等人，2016）。
乙二酸循环也发生在细菌、真菌和原生生物中，但在人类和动物组织中不存在（Chew等人，2019；Graham，2008）。异柠檬酸裂解酶（ICL）作为乙二酸循环的关键酶，在Mycobacterium tuberculosis (Mtb)的持续存在和潜伏感染中发挥了重要作用，近年来已成为药物开发的一个有前景的目标（Bhusal等人，2017；Negi和Sharma，2023）。Mtb的ICL结构首次由Sharma等人（2000）解析，已经提出了多种天然和合成的ICL抑制剂，包括异戊二酸、3-硝基丙酸、3-溴吡ruvate和phthalazinyl衍生物（Negi和Sharma，2023；Sharma等人，2000）。迄今为止，尚未在植物物种中进行类似的研究。
将ICL作为在杂草早期生长阶段进行抑制的方法尚未在新的除草剂作用机制研究中得到探索。因此，在本研究中，基于A. thaliana的氨基酸序列构建了一个ICL的计算机模拟三维模型（ArThaICL），通过虚拟筛选模拟来识别潜在的配体。进行了体外和体内实验，以评估选定的配体对某些作物和杂草物种的萌发和初期发育的影响，这些物种对脂质储备的依赖程度不同。
在一种敏感的杂草Euphorbia heterophylla中研究了选定的ICL抑制剂的作用机制。这种杂草以其能够在早期阶段与作物成功竞争而闻名，因为它生长迅速，并能在幼小的作物植物上形成密集的冠层（Wilson，1981）。除了具有侵略性行为外，E. heterophylla已经对多种除草剂产生了抗性，包括草甘膦和乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制剂（Trezzi等人，2005；Vidal等人，2007），这强调了寻找控制这种杂草的新方法的重要性。
试剂和植物材料
DL-异柠檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、二硫苏糖醇（DTT）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、异戊二酸（IA）、琼脂、三氯乙酸（TCA）、苯肼盐酸盐、铁氰化钾、蔗糖、2-巯基乙醇、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（氧化型）（NADP+）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（还原型）（NADPH）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（还原型）（NADH）、葡萄糖、磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、三磷酸腺苷
ArThaICL结构模型验证和计算机模拟
本研究基于A. thaliana的氨基酸序列，使用Aspergillus nidulans和Magnaporthe oryzae的ICL作为同源建模的模板，构建了异柠檬酸裂解酶（ArThaICL）的结构模型。A. thaliana的ICL序列与Aspergillus nidulans模板蛋白之间的相似度为52.8%，这被认为足以进行同源建模（补充图A.2）。为了构建三维模型，选择了最佳的模型
结论
使用ArThaICL模型进行的虚拟筛选显示，只有少数化合物能够选择性地抑制植物异柠檬酸裂解酶，其中只有异戊二酸在体外和体内都表现出生物活性。总体而言，子叶中脂质含量较高的物种表现出更明显的幼苗生长抑制。然而，在温室条件下实现杂草死亡所需的浓度非常高，表明异戊二酸的除草效果有限
CRediT作者贡献声明
保罗·维尼修斯·莫雷拉·达·科斯塔·梅内塞斯（Paulo Vinicius Moreira da Costa Menezes）：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿、软件使用、方法论、研究、数据分析、概念化。伊莎贝拉·费雷拉·恩里克（Isabela Ferreira Henrique）：研究。拉里萨·阿尤米·卡吉哈拉（Larissa Ayumi Kajihara）：研究。加布里埃尔·费利佩·斯图普（Gabriel Felipe Stulp）：方法论、研究、数据分析。埃里卡·瓦基达（Erika Wakida）：研究。伊莎贝拉·德·卡瓦略·孔特塞托（Isabela de Carvalho Contesoto）：研究。安娜·拉奎尔·帕帕·阿努西阿桑（Ana Raquel Papa Anuncia??o）：研究。安娜·卢伊扎·桑托斯·瓦格纳（Ana Luiza Santos Wagner）：
资助
本研究得到了国家科学技术发展委员会（CNPq-3098181/2021–4）和Araucaria基金会（PRONEX-013/2017）的资助。P.V.M.C.M.获得了高等教育人员协调委员会（CAPES）的奖学金。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
