《Pigment Cell & Melanoma Research》：A Short Report on Melanocyte/Melanoma Culture, Senescence, and Reproducibility
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本研讨会报告（源自2025年欧洲色素细胞研究学会（ESPCR）会议）系统总结了色素细胞（如黑色素细胞、黑色素瘤细胞、角质形成细胞、成纤维细胞）体外培养中面临的普遍挑战与技术陷阱。报告不仅强调了低密度接种、温度波动、过度传代、支原体污染、培养基批间差异等因素对实验结果可重复性的巨大影响，还探讨了人、小鼠、斑马鱼等不同物种模型间的生物学差异。文章倡导通过透明、详尽的实验条件记录（而非追求单一的“金标准”方案）来提升研究可比性，并展望了多能干细胞（PSC）来源色素细胞、大型哺乳动物模型等新兴工具的互补价值。
引言：研讨会背景与目标
在皮肤生物学、发育生物学和癌症生物学研究中，对黑色素细胞及其相关细胞（如角质形成细胞、成纤维细胞）的探索面临着持续的技术和方法学挑战。尽管这些细胞类型被广泛使用，但实验室在细胞培养方案的标准化、可重复性和记录方面常遇到问题。研究黑色素瘤时，这些挑战更为复杂，因为细胞行为会因患者个体、细胞系、传代历史和培养条件的不同而产生巨大差异。2025年欧洲色素细胞研究学会（ESPCR）在埃尔兰根举办的“色素细胞模型：敏感性、创新与细胞培养挑战”研讨会，旨在通过提供一个讨论和知识分享的平台来解决这些问题。其核心目标是：识别和强调黑色素细胞、角质形成细胞、成纤维细胞和黑色素瘤原代培养物及细胞系培养中常见的技术陷阱；探索包括三维培养系统、类器官和共培养技术在内的替代模型；并通过鼓励严谨的记录、透明的方法报告和通用标准的开发，来促进色素细胞研究的可重复性。
细胞培养中的关键挑战
皮肤细胞的培养具有直接影响实验结果的独特挑战。与永生化或转化的细胞系不同，原代细胞保留了其原位和体内环境的许多特征，使其对操作、培养条件和培养基成分的快速变化非常敏感。主要的变异性来源包括技术陷阱、质量控制、以及培养基与环境因素。
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技术陷阱
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低密度接种：为避免周末维护，常在周五以低密度（如低于约2–5 × 103细胞/cm2）接种细胞。这种做法虽方便，但会使细胞承受显著压力，可能加速遗传和表型漂变，影响色素沉着和增殖状态，从而降低可比性和可重复性。斑马鱼黑色素瘤细胞对稀疏接种尤其敏感。
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温度不一致：使用冷的培养基或突然的温度变化会损害细胞生长动力学，改变细胞代谢，影响蛋白质折叠，并破坏黑色素生成通路，增加反应的变异性。值得注意的是，一些培养基成分（如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF））在温度升高时更不稳定。建议将复溶的培养基分装成小工作 aliquot，使用前仅预热至所需温度的最短时间，或先将添加了血清的培养基保存在4°C，在细胞传代前再加入从冻存 aliquot 中解冻的生长因子。
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过度融合与过度传代：达到过度融合或传代次数过多的培养物常常会失去其定义特征，导致实验失败或产生误导性结果。过度融合和传代可深刻改变黑色素细胞的形态和色素沉着。成熟的、有功能的黑色素细胞通常是有色素且多树突状的（“星形”），而具有未成熟、双极形态的细胞则可能表达一些神经嵴干细胞（NCSC）标志物，并具有多向分化潜能。因此，系统记录每次传代时的细胞形态、在预定传代数冻存细胞库、并主动监测分化状态至关重要。
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“传代前两代”原则：为确保可重复性，实验规划应至少在实验开始前至少两个传代时启动。这个稳定期允许细胞从压力中恢复，并确保培养条件与计划的分析保持一致。然而，对于直接从患者获得的原代培养物，在可能的情况下建议将其在培养中的时间限制在单个传代内。
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质量控制与标准化
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支原体与污染：来源于皮肤的培养物特别容易受到支原体污染，这会强烈影响细胞代谢和生长动力学。应定期进行支原体检测，如果呈阳性，细胞应被丢弃，并重新开始实验。
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细胞鉴定：需要严格且持续地控制细胞身份。建立方法以定期确认所用细胞的同一性，并考虑定期进行短串联重复（STR）基因分型以验证细胞系。
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命名法：当黑色素细胞的原代培养物产生新的细胞系时，应尽可能清晰地命名，并记录命名的依据。
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培养基与补充剂
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品牌与批次变异性：即使是名义上相同的培养基（如RPMI 1640），不同供应商和批次之间的配方在离子和营养成分组成以及缓冲能力方面可能存在显著差异。这种差异可对细胞功能（如转录因子活性、下游信号传导或色素沉着）产生深远影响。
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操作实践：正确的培养基和补充剂处理对于维持细胞活力、反应和表型至关重要。这包括：避光保存（防止光降解）、使用前预热至37°C、维持正确的二氧化碳（CO2）浓度、将不稳定因子分装成单次使用 aliquot 以减少反复冻融，以及在新鲜培养基中添加一部分旧的条件培养基，以帮助缓冲传代带来的压力。
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确定成分与专有配方：较早的黑色素细胞培养方案依赖于指定的补充剂，而许多现代商业配方是专有且不公开的，这引发了关于非预期通路激活或抑制的担忧，引入了可能影响实验结果的隐藏变量。
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环境因素：主要可控的环境因素包括pH、温度和CO2。氧气水平也可以调节，但通常需要专门的设备。皮肤表面的pH通常比标准培养条件（pH ~7.1–7.5）更偏酸性。人体皮肤通常在32°C–36°C下发挥功能，而标准培养箱维持在37°C。二氧化碳浓度的波动直接影响缓冲能力和pH。体内表皮氧气浓度相对较低（1%–5%），而在大气氧（~20%）中生长的培养物会经历高氧应激，这可能加速氧化损伤、减慢倍增时间并改变色素沉着通路。
黑色素细胞模型与衰老
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人与小鼠 vs. 斑马鱼：一个主要区别是，小鼠皮肤黑色素细胞主要位于毛囊中，而非遍布表皮。斑马鱼的黑色素细胞则通常包含在鳞片结构或真皮中。这意味着不同物种的黑色素细胞暴露于不同的微环境。此外，小鼠黑色素细胞比人类黑色素细胞具有更长的端粒，这使得它们能够更长时间地抵抗衰老。小鼠黑色素细胞可以通过自发或靶向删除编码p16的Cdkn2a来绕过衰老，而人类黑色素细胞通常需要同时失活P16（或表达CDK4）和活跃的端粒维持才能达到类似效果。所有细胞培养物都容易在连续传代过程中发生遗传漂变，因此仔细的细胞库生成、准确的传代追踪和常规鉴定对维持实验一致性至关重要。
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Hermes细胞系：这些是经过充分表征的永生化人类黑色素细胞系，经过遗传操作以失活CDKN2A并表达人端粒酶逆转录酶（hTERT）。它们的主要用途是长期实验，但在分化状态、表观遗传景观或衰老反应方面可能无法完全重现原代黑色素细胞的表型。
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iPS与ES细胞来源的黑色素细胞：黑色素细胞可以通过模拟胚胎发育的分步分化过程从多能干细胞（iPSC和ESC）产生。通常包括：引导多能细胞向内胚层谱系分化；内胚层分化为神经上皮和神经嵴细胞（表达Sox10、Foxd3和Pax3等转录因子）；命运限制为施万细胞前体和表达Mitf的成黑色素细胞，最终成熟为功能性黑色素细胞。分化效率和保真度可以通过操纵关键信号通路和细胞环境来增强，例如激活Wnt通路、抑制BMP介导的SMAD信号传导、使用EdnrB激动剂、调节cAMP以及补充铜等微量元素。人类和小鼠多能干细胞在分化效率、谱系定向和最终黑色素细胞表型方面存在显著差异。
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挑战：在永生化黑色素细胞系中，尝试用小分子或应激源诱导衰老常常失败或导致细胞死亡。常用的包皮来源的成纤维细胞、角质形成细胞和黑色素细胞可能无法准确反映成年组织生理学或疾病相关状态，并且其使用将研究限制在男性新生儿无毛皮肤细胞。供体的年龄、性别、光型和组织来源可深刻影响衰老开始、增殖率和实验结果。
可重复性与标准化
可重复性是稳健科学研究的基石，但在基于细胞的研究中，尤其是在正常黑色素细胞和黑色素瘤模型中，仍然是一个重大挑战。标准化通常被视为解决方案，但在实践中，变异性是不可避免的。变异性不应仅仅被视为实验噪音，如果被适当记录和解释，它可以成为生物学信息。
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实验室间的变异性：即使使用表面相同的细胞系，实验室之间也会出现显著差异。例如，黑色素细胞培养物在基因表达谱、色素沉着水平和细胞形态方面表现出实验室间和实验室内的变异性。黑色素瘤来源的细胞系往往更稳健，在转录组分析中显示出一致的聚类，但这并不能完全消除变异性。
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报告：为色素细胞培养研究设立报告标准至关重要，以便在发表的研究中提供所有相关信息。建议的报告标准涵盖多个方面，包括：细胞身份和来源（细胞类型、物种、组织来源、供体年龄和性别等）；供体和样本元数据；培养历史和传代信息；培养基和补充剂（名称、制造商、批号、关键添加剂浓度）；环境和操作条件（温度、CO2、氧气、pH、光照）；细胞密度和融合度；细胞表征和质量控制（鉴定方法、支原体检测）；遗传和表观遗传状态（关键突变、遗传操作方法）；以及分化状态和功能验证（标志物、色素沉着测定）。
替代模型与物种
理解黑色素细胞生物学和黑色素瘤进展得益于探索人类细胞系之外的模型。不同物种和模型系统提供了独特的见解，各有优势和局限性。
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鱼类和两栖动物：斑马鱼广泛用于研究黑色素细胞发育、色素沉着模式和角质形成细胞相互作用，因其胚胎透明和遗传易操作性。已建立了多种特征明确的斑马鱼黑色素瘤细胞系（如ZMEL1， ZCREST1），并已保持稳定超过10年。它们在被移植回鱼体时容易产生侵袭性和转移性黑色素瘤。其他物种如青鳉、洞穴鱼、鳉鱼、鲑鱼等，允许研究替代的色素细胞类型、进化适应和与衰老相关的色素变化。非洲爪蟾等两栖动物模型在遗传和癌症研究方面被认为与人类的相关性较低，但技术优势有时会超过这些考虑。使用鱼类和两栖动物细胞系的一个普遍注意事项是，它们通常在20°C–28°C的不同温度范围内生长，这在与人比较时应予以考虑。
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大型哺乳动物模型：猪、狗、马提供了比啮齿动物更接近人类皮肤的生理学和解剖学相关性。某些犬种会患上与人类疾病具有相似遗传特征的粘膜黑色素瘤，使其成为细胞系和转化研究见解的宝贵来源。猪和马有助于色素沉着和皮肤生物学研究，尽管后勤和成本考虑限制了广泛采用。灵长类动物研究主要受伦理考虑的限制。
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方案决策与伦理考虑：跨方案的标准化程度相对较高；然而，关键决策（如分化线索的选择和物种的选择）继续反映了历史先例以及伦理、监管和实际约束。这些因素决定了哪些物种可用于研究，影响了实验设计，并影响了转化相关性。
标准化 vs. 记录
详尽的记录远比单一的“金标准”更有价值，因为当标准改变时，重新审视旧的工作通常是富有成果的。关键因素包括传代次数、遗传状态、气体和培养基成分、供体来源和培养温度。所有这些都需要在出版物中明确说明。拥抱变异性可以揭示生物学见解，而像protocols.io和bio-protocol.org/exchange这样的社区平台有助于传播共享的、可分支的、不断发展的方案。
结论
黑色素细胞和黑色素瘤的研究受到生物脆弱性、物种特异性差异和方法学限制的影响。关键要点包括：黑色素细胞培养的脆弱性——对培养基成分、操作实践、供体来源和微环境因素高度敏感；传代历史——适当的规划确保细胞处于最佳状态，理想情况下至少在实验前两个传代进行监测；物种差异——人和小鼠黑色素细胞在pH耐受性、氧气敏感性、端粒动力学、衰老和分化能力方面存在差异；记录优于标准化——透明报告所有培养条件、传代历史和培养基成分对于可重复性至关重要；替代模型以补充人类研究——许多脊椎动物和ES或iPSC衍生系统提供了互补的机制见解和转化相关性；确定成分培养基以提高可重复性——依赖专有商业配方会引入长期变异性并降低实验室间的可比性；通过社区参与加强科学——分享包括挑战和失败在内的方案，促进集体学习和可重复性的改进。
