鉴定并基因型分析导致土耳其卷心菜黑腐病的Xanthomonas campestris pv. campestris菌株
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黑腐病病原菌 Xanthomonas campestris pv. campestris 在土耳其尼吉德省的分离体经表型与分子遗传学分析，证实为当地主要致病菌。通过 Rep-PCR 和 MLSA (利用 dnaK、gyrB、rpoD 基因) 检测，结合系统发育分析，揭示分离体形成三个主群，其中 rpoD 基因遗传异质性显著，优于其他两个基因作为分型标记。研究结果为当地抗病育种和病害管理提供分子依据。
Tu?ba ERO?LU|Eminur EL??
土耳其尼德省奥默·哈利斯德米尔大学农业科学与技术学院植物生产与技术系
摘要
由普遍存在的细菌Xanthomonas campestris pv. campestris引起的黑腐病，被公认为是对卷心菜（Brassica oleracea var. capitata）作物造成重大经济损失的主要细菌性疾病。在本研究中，从尼德省（土耳其主要卷心菜生产区之一）采集的症状性卷心菜叶片和茎部样本中分离出的细菌株进行了表型和基因型分析。表型分析包括烟草 hypersensitivity 测试、果胶分解活性、致病性测试以及革兰氏染色实验；分子分析则使用了针对致病型的特异性标记（Xcc_53-F/R）进行 PCR 扩增，以确认这些分离株的身份。为了评估X. campestris pv. campestris分离株之间的遗传变异，采用了基于重复 DNA 序列的 PCR（Rep-PCR）技术（包括 ERIC 和 BOX-PCR 方法）。通过层次聚类分析（UPGMA 方法），这些分离株被分为三个主要群组。这些聚类模式表明该地区X. campestris pv. campestris分离株的遗传多样性较低，这一结论也得到了主成分分析的支持。基于 rep-PCR 结果，选择了十个代表性分离株进行多基因座序列分析（MLSA），使用的三个参考基因分别是分子伴侣蛋白 DnaK（dnaK）、DNA 旋转酶亚基 B（gyrB）和 RNA 聚合酶 sigma 因子 RpoD（rpoD）。有趣的是，dnaK 和 gyrB 基因表现出遗传一致性，而 rpoD 基因则显示出遗传异质性。根据串联序列构建的系统发育树显示这两个主要群组之间存在差异。这些结果证实X. campestris pv. campestris是该地区卷心菜黑腐病的致病菌，并表明使用 rpoD 基因作为核苷酸变异的标记比 dnaK 和 gyrB 更有效。这些发现有望为了解该地区的黑腐病病原体及其控制方法提供依据。
引言
黑腐病由革兰氏阴性维管植物病原体Xanthomonas campestris pv. campestris引起，是Brassicaceae科植物（尤其是卷心菜、西兰花和花椰菜）的主要细菌性疾病[1]、[2]。该病首次于1889年在美国被报道[3]，此后在全球范围内传播，可在易感品种中导致高达60–70%的产量损失[4]。目前该病原体存在于六大洲的93个国家[5]：非洲[6]、[7]、亚洲[8]、[9]、[10]、[11]、北美洲[12]、南美洲[13]、欧洲[14]、[15]、[16]、[17]以及大洋洲[18]。
该病的特征是叶片边缘出现明显的V形黄化病斑，并伴有维管组织变色。病原体主要通过水孔进入植物体内，随后系统性定殖于维管系统，导致木质部阻塞、水分运输受阻，从而引起植株萎蔫[19]、[20]。迄今为止，已报道了11个X. campestris pv. campestris菌株类型（1–11），其中1型和4型在欧洲、澳大利亚和北美洲最为常见[15]、[21]、[22]。该病原体的菌株结构具有动态性，不同地理区域的菌株类型存在差异[15]；例如，在英国主要存在1–6型[22]，在尼泊尔存在1、4、5、6、7型[9]，在西班牙存在1、4、5、6、7、8、9型[23]；南非[24]和巴西[13]主要存在1、3、4、6型；此外，巴西还发现了9型[24]。印度[11]和意大利[14]也观察到1、4、6型的主导地位，而在葡萄牙发现了新的10型和11型，这表明病原体的菌株结构仍在演变[15]。
尽管黑腐病具有全球影响，但它仍然是卷心菜生产中的主要问题之一，也是最难控制的疾病之一，因为目前尚未制定出有效的全球管理策略[25]。虽然培育抗性品种是最理想的方法之一，但由于抗性种质的稀缺以及对抗性遗传机制和控制基因了解不足，育种工作受到阻碍[26]。大多数研究表明，抗性由一对隐性主基因在杂合状态下控制[26]、[27]、[28]、[29]，但也有研究报道单基因控制[30]、[31]。
鉴于X. campestris pv. campestris内部的显著遗传变异，全面了解其遗传特征对于有效选择抗源、开发稳健的育种计划以及实施管理策略至关重要[13]。精确鉴定和分型Xanthomonas分离株的主要方法基于重复序列的DNA指纹技术，如重复外源回文（REP）序列、肠杆菌重复基因间共识（ERIC）序列和 BOX 序列（BOX）[11]。此外，使用不同参考基因（如 RNA 聚合酶 sigma 因子 RpoD（rpoD）、分子伴侣蛋白 DnaK（dnaK）和 DNA 旋转酶亚基 B（gyrB）的多基因座序列分型（MLST）和多基因座序列分析（MLSA）提供了高分辨率鉴定的补充方法[32]。这些方法的结合应用是准确鉴定和全面评估细菌遗传变异的最有效途径[33]。
2022年，土耳其的卷心菜产量占全球总量的约1%，产量为96.4万吨，排名世界第11位[34]。2023年，全国卷心菜产量达到约70万吨，其中尼德省作为第二大生产区贡献了13.2万吨[35]。然而，由X. campestris pv. campestris引起的黑腐病是限制尼德省卷心菜产量和质量的主要细菌病原体[36]。尽管该病具有经济重要性，但现有文献显示土耳其对该病的研究仍有限，尤其是关于X. campestris pv. campestris分离株的基因分型信息极为缺乏。由于鉴定和遗传特征分析对于制定有效的病害管理策略至关重要，本研究旨在调查土耳其尼德省X. campestris pv. campestris分离株的鉴定和基因分型情况。为此，采用了包括 hypersensitivity 反应、果胶分解活性、致病性测试以及 PCR、Rep-PCR 和 MLSA 等分子分析在内的综合方法。此外，还进行了层次聚类、主成分分析和系统发育分析，以阐明分离株之间的遗传关系。
样本采集与病原体分离
2023年7月至9月期间，收集了表现出黑腐病症状的卷心菜（Brassica oleracea var. capitata）叶片和茎部样本用于鉴定研究。调查在尼德省博尔区的9个地点进行，每个地点采集了25块受感染的卷心菜田，每块田平均采集8-10株受感染植株。受感染材料先用2%次氯酸钠（NaClO）溶液表面消毒3分钟，然后放在滤纸上晾干
田间观察
在尼德省的不同地点进行的调查显示，许多田块中都存在该病的症状。主要症状包括叶片边缘出现V形黄化病斑并伴有黑色脉纹，以及茎部维管组织变暗（图1）。这些观察结果与全球范围内报道的卷心菜黑腐病特征一致。
Xanthomonas campestris pv. campestris的鉴定
经过培养后，选择了典型的淡黄色纯培养株用于后续研究
讨论
X. campestris pv. campestris引起的黑腐病是Brassicaceae植物的主要病害，会显著降低作物的质量和产量[11]。由于该病具有种子传播性、病原体变异性以及化学控制方法效果有限，加之抗性品种匮乏，因此其管理一直颇具挑战性[41]。鉴于病原体鉴定和遗传特征分析对于制定针对性管理策略至关重要，
结论
本研究全面描述了来自土耳其尼德省的X. campestris pv. campestris分离株的特征，提供了关于该地区黑腐病病原体遗传结构的重要信息。通过结合表型筛选和分子分析的详细鉴定方法，成功确认所有分离株均为X. campestris pv. campestris。Rep-PCR 分析揭示了该病原体内部的遗传亚群差异
作者贡献声明
Tu?ba ERO?LU：负责撰写初稿、开展研究及进行形式分析。Eminur EL??：负责撰写、审稿与编辑、验证、方法设计、研究实施、资金获取、数据管理及概念构思
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
资金来源
本研究得到了尼德省奥默·哈利斯德米尔大学科学研究项目协调单位（BAP项目编号TGT 2025/3-BAGEP）的支持。资助方未参与研究设计、数据收集与分析或手稿撰写。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究是 Tu?ba ERO?LU 的硕士论文的一部分。作者感谢尼德省奥默·哈利斯德米尔大学的 Nida UYSAL 博士提供的技术指导。
