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葡萄糖硫苷（GLs）生物合成中，SUR1基因编码的C-S解链酶突变导致生长缺陷和生长素（IAA）过量积累，其机制与MYB34转录因子调控相关。本研究发现MYB34部分缓解SUR1突变体的生长问题，但无法抑制IAA过度，同时发现SUR1突变体仍能积累部分吲哚型GLs，表明存在其他C-S解链酶参与GLs合成。
Mariola Pi?lewska-Bednarek|Pawe? Czerniawski|Sylwia Kuczewska|Serhii Kozin|Anna Piasecka|Pawe? Bednarek
波兰科学院生物有机化学研究所，Noskowskiego 12/14，61-704 波兹南，波兰
摘要
葡萄糖苷（GLs）是来自十字花科植物的含硫特化代谢物。它们可以通过复杂的生物合成途径由多种氨基酸衍生而来。该途径中的大多数步骤涉及多种氨基酸特异性和/或冗余的相应酶的异构体。根据已发表的结果，在模式植物拟南芥中，这一规则的例外是Superroot1（SUR1），它被认为是唯一能够催化由不同氨基酸衍生的-烷基-硫羟基酸中间体中的C-S键裂解的酶。值得注意的是，SUR1的突变不仅会破坏GL的生物合成，还会导致严重的生长表型和致死性，这可能是由于生长素过量产生以及有毒GL生物合成中间体的积累所致。在这项研究中，我们发现sur1植物中生长素的增加依赖于MYB34转录因子，该因子是控制Trp衍生GL生物合成的MYB之一。与其对IAA积累的影响不同，myb34突变仅部分削弱了生长表型，并未能阻止sur1突变的致死性。令人惊讶的是，我们发现sur1植物仍然能够积累与野生型植物相当量的吲哚类GL，这表明还有其他C-S裂解酶参与了这些特化代谢物的生物合成。
引言
葡萄糖苷（GLs）是一类独特的含硫和氮的特化代谢物，具有防御功能，由十字花科植物产生，包括模式植物拟南芥（Halkier和Gershenzon，2006；Pastorczyk和Bednarek，2016）。根据前体氨基酸的不同，这些化合物可以分为两大类：脂肪族GL（AGLs，主要来源于Met）和吲哚类GL（IGLs，来源于Trp）（Bla?evi?等人，2020）。GLs通过一个保守的途径持续产生，该途径包括前体修饰、核心生物合成和GL修饰模块（S?nderby等人，2010b；Jensen等人，2014；Barco和Clay，2019）。在核心生物合成的第一步中，Trp和延长的Met通过属于CYP79家族的特定细胞色素P450单加氧酶转化为相应的醛肟。其中，CYP79B2和CYP79B3将Trp转化为吲哚-3-醛肟（IAOx），而CYP79F1和CYP79F2处理延长的Met和Phe变体（图1）（Mikkelsen等人，2000；Zhao等人，2002；Chen等人，2003；Wang等人，2021）。在第二步中，CYP83单加氧酶将醛肟转化为腈氧化物或aci-硝基化合物。CYP83B1/SUR2（Supperroot2）代谢IAOx，而CYP83A1专门作用于脂肪族醛肟（Bak等人，2001；Naur等人，2003）。所得中间体通过与谷胱甘肽（GSH）的结合而被谷胱甘肽-转移酶作用，但这些转移酶的身份尚未得到明确确认。接下来，γ-谷氨酰肽酶1（GGP1）和GGP3去除γ-Glu（Geu-Flores等人，2011）。然后，中间体中的C-S键通过-烷基-硫羟基酸裂解酶（C-S裂解酶，即SUR1）被裂解，生成相应的硫羟基酸（Mikkelsen等人，2004）。这些化合物随后通过UGT74家族的UDP-葡萄糖基转移酶进行-葡萄糖基化，再由磺转移酶SOT16、17和18进行硫酸化，最终生成GL分子（图1）（Grubb等人，2004；Piotrowski等人，2004）。
GL的生物合成受R2R3 MYB和基本螺旋-环-螺旋（bHLH）MYC家族转录因子的调控（Frerigmann，2016；Mitreiter和Gigolashvili，2021）。在模式植物拟南芥中，已有六种MYB被报道为GL生物合成的正调控因子（Frerigmann，2016；Mitreiter和Gigolashvili，2021）。其中MYB28、MYB29和MYB76被证明控制AGL的生物合成（S?nderby等人，2007；Gigolashvili等人，2008；S?nderby等人，2010a）。另一方面，MYB34/ATR1（Altered Tryptophan Regulation 1）、MYB51和MYB122控制IGL的形成，其中MYB34和MYB51的作用最为显著（Celenza等人，2005；Gigolashvili等人，2007；Frerigmann和Gigolashvili，2014）。
值得注意的是，IGL途径与植物激素吲哚-3-乙酸（生长素；IAA）的生物合成相互关联（图1）（Zhao等人，2002；Malka和Cheng，2017）。这种代谢联系是通过筛选生长素稳态缺陷突变体（包括sur1和sur2/cyp83b1）并对其进行鉴定而发现的（Boerjan等人，1995；Delarue等人，1998）。这两种sur突变体都表现出严重的生长缺陷，包括下胚轴伸长、幼苗期芽发育和根系伸展受到强烈抑制，以及后期发育阶段根毛形成增强和生长严重受阻。这些生长缺陷与IAA积累水平升高和代谢失调有关（Boerjan等人，1995；Delarue等人，1998；Morant等人，2010）。值得注意的是，sur1的生长缺陷比sur2/cyp83b1更为严重；sur1突变在叶莲座期似乎具有致死性。研究发现，这两种< />基因编码的酶参与GL的生物合成，表明IAA积累增加和发育异常是GL生物合成途径紊乱的副作用（Barlier等人，2000；Bak和Feyereisen，2001；Mikkelsen等人，2004）。尽管SUR1被认为是唯一参与GL生物合成的C-S裂解酶（图1），但在sur1纯合子幼苗中仍检测到GL的存在。然而，随着sur1幼苗年龄的增长，GL浓度下降，因此推测检测到的GL可能是来自杂合SUR1/sur1植物种子的储存化合物（Mikkelsen等人，2004）。
后续对sur2/cyp83b1突变体的研究表明，这种突变可能是由于IGL缺乏触发的反馈循环，导致Trp生物合成激活和基因表达升高，进而导致IAOx过量产生并转化为IAA（图1）（Smolen和Bender，2002；Naur等人，2003；Celenza等人，2005）。最近，我们发现sur2/cyp83b1突变体中基因的表达升高明确受到MYB34转录因子的调控。因此，cyp83b1 myb34双突变体表现出与野生型（WT）相似的IAA水平和生长（Czerniawski等人，2023）。
在这项研究中，我们提出了MYB34控制sur1突变体中IAA过度积累和生长受阻的假设。对sur1 myb34植物的分析显示IAA产量明显下降，但生长仅部分恢复。值得注意的是，我们在sur1叶片中发现了类似WT的IGL积累，这表明还有另一种C-S裂解酶参与了GL的生物合成。
部分内容
MYB34部分控制 sur1 植物的生长表型
为了测试MYB34转录因子是否对sur1突变体中的IAA过量产生和生长受阻具有类似的影响，我们决定生成并研究sur1 myb34双突变体。为此，我们选择了来自Saskatoon拟南芥T-DNA文库的SK35014 T-DNA插入系（Robinson等人，2009）。在土壤中培养分离的SK35014植物时，我们发现了一些生长明显受阻的个体
讨论
我们的实验表明，MYB34控制sur1植物中IAA的过度积累。该转录因子基因在< />基因突变中过表达，这反过来激活了编码MYB51和MYB112转录因子以及IGL特异性P450单加氧酶CYP79B2/B3和CYP83B1的表达（图4）。然而，观察到的IAOx过量积累表明，CYP83B1活性的增加不足以有效转化
植物材料
Col-4来自欧洲拟南芥种质资源中心（编号N933）。A. thaliana myb34品系（WiscDsLox424F3）的种子由Dr. Henning Frerigmann（德国科隆大学）提供（Gigolashvili等人，2007；Frerigmann和Gigolashvili，2014）。SK35014是一个携带< />（At2g20610）基因插入的T-DNA系，由Dr. Isobel Parkin（加拿大萨斯卡通研究与发展中心，农业与农业食品部）赠送（Robinson等人，2009）。
CRediT作者贡献声明
Anna Piasecka：撰写——原始草稿，可视化，形式分析。
Sylwia Kuczewska：撰写——原始草稿，研究。
Serhii Kozin：撰写——原始草稿，可视化，形式分析。
Mariola Pi?lewska-Bednarek：撰写——原始草稿，可视化，研究，形式分析，概念化。
Pawe? Czerniawski：撰写——原始草稿，可视化，方法学，研究。
Pawel Bednarek：撰写——原始草稿，监督，项目管理，
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们要感谢Veeresh Lokesh对手稿的校对。我们还要感谢在NEBI - 国家生物和生物医学科学成像研究中心（项目编号POIR.04.02.00-00-C004/19）开发的基础设施的支持，该项目得到了欧洲区域发展基金（ERDF）在2014-2020年智能增长运营计划（措施4.2 现代科研基础设施发展）框架内的共同资助。
