《Plant, Cell & Environment》：Phytohormonal and Transcriptomic Mechanisms of Multigenerational Stress Memory in Wheat Under Weed Competition
Phytohormonal and Transcriptomic Mechanisms of Multigenerational Stress Memory in Wheat Under Weed Competition
1 引言
植物面临着多种生物和非生物胁迫，需要复杂的适应性反应来生存和维持生产力。杂草竞争是一种主要的生物胁迫，它会降低资源可得性并造成显著的产量损失。例如，地肤（Bassia scoparia）和意大利黑麦草（Lolium multiflorum）是小麦（Triticum aestivum）的极具侵略性的竞争者，可分别导致春小麦减产73%和冬小麦减产92%。与经典的生物胁迫（如病虫害）不同，杂草竞争具有双重特性：一方面主要通过竞争光、水、营养和空间施加胁迫，其机制类似于非生物胁迫；另一方面则通过释放次生代谢物产生化感作用干扰，这更类似于生物胁迫。这种双重性质会激活重叠的胁迫响应通路，其中资源限制激活非生物胁迫激素，而化感作用和竞争信号可能触发生物防御反应。
近期研究表明，多世代胁迫启动（即上一代植物经历胁迫后，其后代表现出更强的恢复力）可能为减少农业化学品投入提供一个有前景的途径。通过激活内在防御机制，胁迫启动诱导了胁迫记忆，使植物能够“记住”先前的胁迫事件，并调整其对未来挑战的响应。这种跨代激活内在防御机制的形式，有助于通过最小化除草剂的使用来促进更可持续的农业实践。胁迫记忆由转录重组、表观遗传变化和激素信号传导介导，使植物能够增强其防御机制或保存资源。然而，适应性胁迫记忆（再次暴露时性能增强）与适应不良反应（长期或不匹配的胁迫导致的适应成本）之间的区别仍不清楚，尤其是在跨代的长时间尺度上。
尽管关于多世代胁迫启动的研究文献不断增多，但关于其对作物-杂草互作影响的研究仍存在显著空白。考虑到杂草可导致10%至98%的作物产量损失，探索胁迫启动在减轻这些损失中的作用具有重要意义。此外，不同杂草物种通过不同的资源利用策略和/或化感能力施加不同的竞争压力，但作物如何跨代整合和“记住”这些多方面胁迫仍是未知领域。
植物激素，如脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）和水杨酸（SA），是胁迫响应的关键整合因子。ABA在水分和营养限制下调节气孔关闭和根系生长。生长素和细胞分裂素调控根系结构和养分获取。同时，JA和SA介导对生物挑战的防御反应，包括邻近植物检测和化感胁迫。这些通路之间的相互作用反映了杂草竞争的综合性，植物必须同时应对资源稀缺（类似非生物）和化学干扰（类似生物）。研究表明，这些植物激素也有助于多世代胁迫启动，塑造即时和可遗传的响应。
转录组学的进步为研究胁迫记忆的分子机制提供了新机会。差异基因表达研究揭示了参与胁迫反应的关键通路，包括激素信号传导、结构强化和代谢适应。例如，乙烯响应因子（ERF）、Nam-Ataf-Cuc（NAC）、WRKY和髓细胞组织增生症（MYB）相关蛋白等转录因子调控这些通路，介导生长与防御之间的权衡。
小麦是世界上最重要的主粮作物之一，为超过20亿人提供主食。其适应性和经济重要性使其成为研究多世代作物-杂草互作的理想“模式”作物。然而，多世代胁迫启动在增强小麦对杂草竞争的适应力方面的潜力仍未得到充分探索。
本研究基于先前的一项工作展开，该工作发现小麦经历五代杂草或小麦竞争后，对小麦产量和生物量性状表现出潜在适应不良和有益的影响。为了阐明这些表型反应的潜在机制，我们在三种生物学上不同的竞争情景下，研究了跨代的激素和转录组变化。地肤是一种侵略性的C4杂草，具有深主根、高耐旱性和已知的化感能力；而意大利黑麦草是一种快速生长的C3竞争者，能迅速消耗土壤氮并遮蔽小麦冠层。这些种间竞争者代表了不同的资源利用策略和化学干扰机制。相比之下，小麦种内竞争提供了一个在不存在杂草特异性性状（如化感作用或不同的资源获取策略）情况下的比较，使我们能够区分杂草特异性胁迫记忆与一般的拥挤响应。通过整合植物激素定量和转录组分析，本研究旨在阐明小麦如何适应多世代竞争胁迫。具体目标包括：表征关键植物激素（如ABA、JA、SA、IAA、细胞分裂素、JA-Ile、OPDA）在多世代作物-杂草互作中的变化；评估与多世代作物-杂草互作相关的差异表达基因（DEGs）和关键功能通路；探索激素调控与转录重组在多世代作物-杂草互作中的相互作用。
2 结果
2.1 不同处理和世代间的植物激素动态
在先前的研究中，我们报告了经历五代杂草或小麦竞争后，多世代胁迫记忆对小麦产量和生物量的潜在适应不良效应。具体而言，纯小麦（WO）和小麦-地肤（WK）处理在第三代（Generation 3）表现出生物量和产量的峰值，随后在后续世代下降，而小麦-黑麦草（WR）和小麦-小麦（WW）处理在不同世代间表现不一。
本研究揭示了与第0代（亲本种子）相比，不同处理和世代间植物激素水平的显著变化。所检测的植物激素包括生长素（IAA）、细胞分裂素（cZ、cZR、tZ）、茉莉酸盐（JA、JA-Ile、OPDA）、SA和ABA。
SA水平急剧增加，在WO第2代增加了151%，在WW第1代增加了101%。WK和WR处理分别在第2代和第3代增加了74%和72%。JA和JA-Ile在所有处理中持续下降，JA在WO第2代减少了80%，JA-Ile在第5代减少了85%。WK和WR表现出类似的减少，下降幅度分别高达81%和89%。相比之下，OPDA增加，在WO第3代增加了八倍，WK和WW处理在第3代和第4代也表现出类似的趋势。
ABA和细胞分裂素的趋势各异。在WO处理中，ABA在第5代达到峰值（增加34%），而WK和WR处理则分别下降高达31%和43%，表明在杂草竞争下ABA信号传导受到抑制。WO中的细胞分裂素水平显示，tZ在第1代增加了171%，第3代增加了77%，随后下降。WK处理在第3代所有细胞分裂素均增加，而WW处理在第5代tZ激增了345%。
这些结果突显了在多世代竞争胁迫下植物激素调控的巨大变异。SA和OPDA在特定处理和世代中增加，而JA和JA-Ile则持续下降。
2.2 转录组测序与组装
从高通量Illumina NovaSeq. 6000平台获得的原始图像数据经过处理后，共构建了168个cDNA文库，产生了8,556,666,686条原始读长。数据过滤后，获得了813,580,414条干净读长和1220.35 Gb的干净碱基。超过90%的干净读长与参考基因组对齐。读长分布分析表明，所有样本中超过80%的对齐读长映射到外显子区域。
2.3 差异表达基因（DEGs）的基因功能分类和富集分析
与WO样本相比，多世代竞争下小麦叶片样本的转录组分析揭示了基因在三大GO类别（分子功能、生物过程和细胞组分）中的显著分布。DEGs的富集分析识别了响应竞争而激活的关键生物过程和通路。GO分类显示了共同的富集模式，胁迫响应、光合作用和代谢调控显著富集。氧化胁迫、激酶活性和信号转导过程在WK、WR和WW处理中均有发生，表明存在共同的胁迫适应机制。
使用KEGG和Reactome数据库进行的通路分析识别了跨处理富集的几种通路。其中，谷胱甘肽代谢、光合作用和激素信号转导高度富集，代表了核心的胁迫适应机制。然而，也出现了不同的模式：WK互作显示次生代谢物生物合成富集，WR强调激素调控和胁迫信号，而WW处理则在能量代谢通路上富集显著。
2.4 基因的差异表达
DEGs的数量（上调和下调）通过设定校正p值（padj）≤ 0.05和绝对log2（倍数变化）≥ 1的阈值来确定，并使用火山图可视化。
在WO处理中，DEGs数量从第1代到第3代稳步增加，在第3代达到峰值（11,729个DEGs，包括7,029个上调和4,700个下调基因），表明强烈的转录组响应。这个峰值与后期世代（如第4代2,763个，第5代2,130个）较低的DEG计数形成对比，反映了随时间推移转录组活性的显著下降。这些趋势表明，在WO处理中，早期差异表达激增，随后可能发生适应或稳定。
WK处理与第0代相比，也发生了显著的转录组变化，尤其是在后期世代。虽然第1代仅显示1,485个DEGs，但数量在第2代增加到4,555个，并在第5代达到峰值（7,045个DEGs）。这表明对长期地肤竞争的适应性响应增强。
WR处理相对于第0代表现出适度但持续的转录组响应。第1代有2,113个DEGs，第3代增加到3,775个，第5代则下降到2,566个，表明转录组活性可能因长期适应黑麦草竞争而降低。
WW处理相对于第0代表现出独特且可变的跨代转录组响应。第1代有9,849个DEGs，随后在第2代（2,860个）和第3代（4,050个）减少，然后在第4代再次上升（7,143个DEGs）。到第5代，DEGs数量降至1,962个，表明转录组响应减弱。
2.5 DEGs的GO术语富集分析
2.5.1 纯小麦（WO）
跨WO世代的DEGs的GO术语富集分析揭示了关键生物过程、细胞组分和分子功能的变化。在第1代，核糖体生物发生和细胞质翻译上调，表明蛋白质合成增强，而光合作用和碳水化合物运输下调，表明资源分配改变。在第2代，L-苯丙氨酸和肉桂酸生物合成过程下调。核糖体亚基基因保持上调，而光合作用组分保持抑制。第3代显示光合作用和细胞多糖代谢进一步下调。叶绿体基质和类囊体膜组分减少与光合能力下降一致。第4代，β-葡聚糖代谢和多糖结合过程上调，表明结构完整性和胁迫信号传导发生变化。到第5代，硝酸盐同化和活性氧（ROS）生物合成上调，反映了氮代谢和胁迫反应的增加。核糖体组分和模式结合活性上调，表明对蛋白质生产和信号调控的持续支持。
2.5.2 小麦-地肤（WK）
跨WK世代的GO术语富集分析揭示了信号传导、代谢和结构过程的变化。在第1代，细胞表面受体信号传导和金属离子运输上调，表明外部信号传导增强。第2代，脂质运输、四吡咯生物合成和质体基质组分下调，反映了叶绿素相关功能的下降。氧化还原酶活性调控显示出混合的转录变化。第3代显示谷胱甘肽代谢和转移酶活性上调，表明专注于解毒和胁迫响应。同时，细胞多糖代谢和光合作用组分下调。第4代，TOR信号传导和其他细胞内调控过程下调，表明代谢信号传导效率降低。到第5代，高尔基体相关囊泡膜组分和次级主动跨膜运输强烈上调，支持胁迫下的蛋白质运输。同时，脂质和锌离子运输下调，表明脂质代谢和微量营养素调控减少。
2.5.3 小麦-黑麦草（WR）
跨WR世代，适应性转变从早期的脂质和苯丙素过程，进展到增强的光合效率。在第1代，离子运输和细胞对饥饿的反应强烈上调，表明细胞强化。转录调控得到上调的DNA指导的RNA聚合酶II和核RNA聚合酶组分的支持。第2代显示细胞表面受体信号传导和氧脂素生物合成上调。苯丙素代谢下调。第3代，细胞壁大分子代谢下调，而模式结合和谷胱甘肽转移酶活性上调。第4代显示受体信号传导和多糖结合增加，反映了环境感知的改善。脂质运输大幅下调。到第5代，钾和锌离子运输上调，强调了养分吸收，反映了适应性的资源获取策略。
2.5.4 小麦-小麦（WW）
WW世代的GO术语富集分析突出了代谢和结构过程的关键转变。在第1代，细胞壁和多糖代谢过程、半纤维素代谢和光合作用下调，表明结构投资和能量生产减少。第2代强调蛋白质合成和胁迫适应，翻译延伸和细胞对饥饿的反应上调。核糖体活性得到转录调控的支持。第3代显示碳水化合物运输和次级主动跨膜运输上调，反映了养分吸收和细胞处理的增强。第4代，光合作用和苯丙素代谢下调，而多糖结合和模式结合活性增加。到第5代，关键代谢通路保持稳定，没有显著上调，而叶绿素结合过程的转录活性保持下调。
2.6 基因表达的层次聚类热图
层次聚类热图显示了与WO第0代相比，四种处理中前100个变异最大的基因（按FPKM值的方差排名）的表达模式，揭示了五代中基因表达的变化。
在WO处理中，第0代和第1代表现出强烈的上调，而第2代和第5代表现出明显的下调。第4代大部分保持上调。值得注意的是，ERF、MYB_related和M-type_MADS等转录因子家族持续高亮，表明它们在胁迫适应中的作用。
在WK处理中，上调在第3代和第4代尤为突出，随后在第2代和第5代下调。与第0代相比，地肤处理组显示出显著变化，反映了对生物胁迫的强烈调控响应。NAC、ERF和MYB-related等关键家族表现出动态变化，表明它们参与了胁迫调节。
在WR处理中，第1代强烈上调，而第3代下调，第4代表现出混合的上调和中性表达。bHLH、ERF和WRKY等基因家族显示出相当大的变异，反映了它们在胁迫响应通路中的作用。
在WW处理中，下调是第1、3、4代的主要趋势，而第2代大部分保持中性，第5代则表现出强烈的上调。M-type_MADS、MYB_related、ERF和WRKY等关键调控家族显示出从下调到第5代显著上调的显著转变，表明在重复的WW互作中适应性响应增强。
2.7 跨世代DEGs的共表达
Venn图显示了每种处理内跨世代DEGs的共表达模式，揭示了独特和共享的基因表达响应。
在WO处理中，33,678个基因在所有五代中持续共表达。独特DEGs数量最多的是在第2代（705个），表明在初始胁迫暴露后转录变化加剧。
在WK处理中，33,573个基因在所有世代共表达。独特DEGs在第2代（554个）和第5代（569个）更为突出。第3代与其他世代有大量重叠。
在WR处理中，33,877个基因在所有五代共表达，是所有处理中共享基因计数最高的。独特DEGs在第2代（626个）也很显著。第3代和第4代与其他世代有广泛重叠。
在WW处理中，33,465个基因在所有世代共表达。独特DEGs在第5代（829个）最为显著，表明在竞争的最后阶段胁迫响应通路被重新激活。与其他处理类似，第2代也显示出相对较高的独特DEGs数量（248个）。
3 讨论
3.1 植物激素和转录组响应与表型结果的整合
本研究中记录的植物激素和转录组变化表现出与先前工作中观察到的表型性能相对应的时间模式。在WO处理中，第3代是一个关键的转变点，与第0代相比，tZ增加了77%，DEGs达到峰值，并且这些分子变化与先前报告的最大生物量和种子产量相吻合。随后的第4代和第5代细胞分裂素下降以及DEGs反映的转录组活性降低，与后期世代生长性能下降一致，表明从适应性向潜在适应不良反应的转变。
在WK和WR处理中，分子变化与表型结果之间的关系更为复杂。两种处理在第2代和第3代均显示SA升高，并且DEGs持续增加至第5代，表明在杂草竞争下持续的转录重组。然而，在这些处理的大多数世代中ABA下降，这与资源限制条件下的预期相反。这些模式表明，激素信号和转录响应的整合并不简单地与竞争性能呈线性关系。
WW处理在第1代表现出最高的初始转录组响应（DEGs数量），这可能反映了对邻近植物存在的快速检测，但这种响应在后续世代减弱，然后在第4代重新出现。第5代tZ的激增可能表明生长促进通路的晚期再激活。
3.2 对多世代竞争的适应性与适应不良的植物激素响应
植物激素数据揭示了跨处理和世代的胁迫信号传导的巨大变异。SA水平在所有处理中显著上升，尤其是在第2代和第3代，表明系统获得抗性（SAR）增强和病原防御启动。相比之下，JA和JA-Ile水平在所有处理中下降，表明茉莉酸盐介导的防御可能存在瓶颈。由于SA和JA通路通常具有拮抗作用，持续的SA升高可能抑制JA响应，从而可能削弱对食草动物和生物胁迫的防御。这一趋势与OPDA水平升高相符，表明在多世代胁迫下茉莉酸盐通路未完全激活。SA的持续升高（通常与病原防御相关）以及JA响应的抑制，表明小麦可能正在激活更适合于生物威胁的防御通路，而非杂草干扰所特有的资源竞争机制。
ABA是植物对非生物胁迫（如干旱和盐分）响应的已知调节因子，也涉及胁迫记忆。然而，跨世代的ABA动态并未遵循资源限制条件的预期模式。在WO处理中，ABA水平波动而无明确方向性趋势。在WK和WR处理中，尽管这些种子系源自经历了资源竞争胁迫的植物，但ABA在大多数世代持续下降。这种反直觉的模式表明，多世代竞争暴露可能改变了ABA敏感性或信号传导，而非简单地维持高水平的胁迫激素。ABA在杂草竞争系后期世代的持续抑制可能代表一种适应不良的遗留效应，即植物下调了本有助于资源获取的胁迫响应。
生长素是生长和胁迫响应的关键调节因子，与第0代相比，所有处理中的IAA水平均有所增加，WW处理在第4代增加最高。这些增加可能反映了适应性响应，以增强根系发育，改善竞争下的养分获取。然而，WK第3代IAA水平的轻微下降可能反映了资源从生长促进向防御或胁迫调控通路的重新分配。
细胞分裂素对细胞分裂和营养分配至关重要，表现出混合响应。tZ在第3代显著增加，尤其是在WW中，而cZ和cZR在WK中达到峰值。这些变化可能有助于第3代观察到的生物量增加。然而，随后WR和WW中cZ和cZR的下降可能反映了细胞分裂素的重新分配，这与多世代竞争下产量和生物量的减少相吻合。
3.3 对多世代竞争的转录组适应
转录组分析揭示了小麦对跨世代竞争响应的显著差异。WO处理显示出基因表达的动态进展，DEGs在第3代达到峰值。这种激增表明由胁迫相关通路驱动的高度转录响应。随后第4代和第5代DEGs的下降反映了转录组活性与第3代峰值相比降低。GO分析显示蛋白质合成和结构强化增加，同时光合作用和碳水化合物运输下调。这些转录组变化可能反映了连续自交产生的多代表观遗传响应，而非竞争驱动的适应。
在WK处理中，转录组响应在第5代达到峰值。早期适应包括上调的受体信号传导和营养动员；然而，第2代光合作用减少表明在生存机制上的适应不良投资。第3代增加的ROS解毒反映了向适应性氧化胁迫管理的转变。氧化还原酶活性的调控（包括上调和下调）意味着对ROS信号传导的动态调节。第3代谷胱甘肽代谢和ROS解毒增加标志着向氧化胁迫缓解的转变。同时，光合作用和多糖代谢过程保持抑制。到第5代，蛋白质运输过程，特别是高尔基体相关囊泡膜和次级主动跨膜运输强烈上调，表明竞争胁迫下细胞内蛋白质运输增强。然而，脂质和微量营养素运输下调，可能标志着代谢优先级的转变。
WR处理显示出适度但动态的转录组响应。早期世代优先考虑结构强化和代谢调整。第2代显示激素信号传导加剧。到第3代，解毒通路上调，而细胞壁代谢下调。第4代强调环境感知。
