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本研究利用时间分辨冷冻电镜（time-resolved cryo-EM）捕捉了神经降压素受体1（NTSR1）激活Gαi1和Gα11异源三聚体的动态过程，揭示了GTP诱导的G蛋白活化通路中多个瞬时中间态结构。研究发现，细胞内环2（ICL2）和ICL3等结构基序在稳定这些中间态、调控G蛋白亚型选择性（subtype selectivity）及信号转导效率中起关键作用，为理解GPCR（G protein-coupled receptor）的G蛋白混杂性（promiscuity）和偏向性信号（biased signalling）提供了新视角。
Snapshots of the dynamic basis of NTSR1 G protein subtype promiscuity
G蛋白偶联受体（GPCR）能够通过四类G蛋白α亚基传递信号。尽管已有数百个无核苷酸的GPCR–G蛋白复合物结构被解析，但G蛋白亚型选择性的机制仍不清楚。近期的研究表明，动态的核苷酸结合中间态可能在这一过程中扮演重要角色。神经降压素受体1（NTSR1）是一种具有高度G蛋白偶联混杂性的受体，其无核苷酸复合物中已观察到非典型的构象。本研究利用时间分辨冷冻电镜，可视化GTP诱导的、与NTSR1结合的Gαi1βγ和Gα11βγ异源三聚体的活化过程，解析了G蛋白活化通路上的多种状态集合，并揭示了稳定这些中间态的结构基序。
Main
GPCR是一个包含超过800个成员的大类受体，可感知多种刺激。尽管配体多样，每个受体仅偶联四类G蛋白（Gαi/o、Gαs、Gαq/11和Gα12/13）中的一个子集，每类G蛋白激活不同的下游信号级联。能够通过更少内源性伙伴信号传导的GPCR配体（称为偏向性信号或功能选择性）因其可能减少副作用、改善药物疗效而备受关注。即使已有数百个覆盖多数G蛋白的GPCR–G蛋白复合物结构，GPCR选择其G蛋白的结构机制仍然知之甚少。近期研究提示，G蛋白选择性并非仅由无核苷酸状态下的受体–G蛋白互补性决定，瞬时的中间态以及涉及G蛋白构象和受体基序（包括ICL2和跨膜结构域5–ICL3–TM6区域）的动态相互作用可能起关键作用。
NTSR1是神经降压素（NTS）的受体，这是一种影响多种生理过程的肽类神经递质和激素。NTSR1是一种混杂的GPCR，可显著激活三类G蛋白，其偏好性为Gαq/11> Gαi/o? Gα12/13。先前对无核苷酸NTSR1–Gi1复合物的冷冻电镜研究揭示了一种与其它家族A复合物相似的典型（C）构象，以及一种受体旋转约45°的非典型（NC）构象。有观点认为NC状态是GPCR–G蛋白结合通路上的一个中间态，需要转化为C状态以允许GTP结合和G蛋白激活；另一种解释则认为这两种状态反映了NTSR1的G蛋白偶联混杂性。
Ensembles of apo and GTP-bound NTSR1–Gi1
本研究首先获得了高分辨率、无偏的无核苷酸NTSR1–Gi1复合物参考结构，解析出三种主要构象：AHD（alpha-helical domain）开放的C状态（C-open-apo）、AHD开放的NC状态（NC-open-apo）以及AHD呈类闭合构象的C状态（C-closed-apo）。C与NC状态的比例约为2:1。高分辨率结构使得能够更精确地比较C和NC状态，主要差异位于TM7–H8区域，NC状态的NPXXY基序呈现一种不寻常且更类似非活性状态的构象。在NC状态中，由于与G蛋白的包装更为松散，ICL2变得更加动态。
随后，通过时间分辨冷冻电镜实验，探测了GTP诱导的NTSR1–Gi1复合物活化。在加入GTP后的6秒和20秒时间点收集数据，并合并处理以获得高分辨率结构。研究发现了四种共享的中间状态：两种是受体呈C或NC取向、AHD开放且存在GTP的状态（C-open-GTP和NC-open-GTP），证明NC构象同样能够结合GTP；另外两种是AHD闭合、α5螺旋回缩、受体仍保持活性样构象的状态，分别对应受体为C取向（C-closed-GTP）和进一步旋转至与C状态近乎成90°的NC样取向（NC-closed-GTP）。
在这两种AHD闭合状态中，α5螺旋的回缩使得ICL2和ICL3承担了受体与G蛋白之间更大部分的有序接触，在NC状态中尤为显著。三维变异性分析（3DVA）显示，尽管C-closed-GTP颗粒中α5螺旋尖端仍有一定程度的结合且受体稳定，但NC-closed-GTP颗粒堆中存在α5螺旋结合减弱与受体密度模糊相关的颗粒。这表明NC-closed-GTP状态可能发生在C-closed-GTP状态之后，更接近于完全复合物解离的路径。在纳米盘环境中重复实验，得到了与去垢剂中几乎相同的构象，证实了这些发现的可靠性。
随时间推移，颗粒群体从AHD开放状态向闭合状态转变，同时NC样状态（特别是NC-closed-GTP）的相对比例增加。这些观察结果支持了一个与最初提议相似的模型：NC状态既是核苷酸交换过程中C状态的前体中间态，也是GTP诱导复合物解离过程中C状态的后继中间态。然而，鉴于NC状态仍能结合鸟嘌呤核苷酸，不能排除不经过C状态的直接NC G蛋白激活可能性。
Unique NTSR1–G11-GTP intermediate behaviour
研究进一步解析了无核苷酸NTSR1–G11复合物的结构，发现其同样存在C和NC两种受体取向，表明NC构象并非Gi特有。在C取向上，观察到两种主要的AHD构象：典型的AHD开放状态和部分闭合的状态。与Gi1相比，G11在所有状态中其α1螺旋均完全或几乎完全伸展，这可能与G11连接子I（linker I）区域一个甘氨酸残基提供的更大灵活性有关。动力学BRET实验表明，交换Gi和Gq的连接子I区域会显著损害Gi1的信号动力学，而对Gq的影响较小，提示Gi1的信号转导针对急剧的开放-闭合转变进行了优化。
然而，在GTP诱导的时间分辨冷冻电镜研究中，NTSR1–G11复合物表现出与Gi1截然不同的行为。未检测到任何NC样取向或AHD开放的颗粒群体。唯一的高分辨率异质重构结果显示，受体呈C取向，AHD闭合，α5螺旋回缩。3DVA和三维分类进一步将该状态分为两类：一类与NTSR1–Gi1的C-closed-GTP状态有大量重叠；另一类中，α5螺旋完全脱离受体，受体变得高度动态，同时G11本身的开关II（switch II）区域开始远离Gβγ并向开关III（switch III）区域移动。这些开关区域的重新排列可能是Gα在完全GTP诱导激活和解离前的最后变化之一，其中涉及的关键残基（如GRE基序）此前已被生化证明对GTP诱导的激活至关重要。
NTSR1在G11-C-closed-GTP状态中的取向与Gi1状态相比有约10°的旋转，这可能是为了避免与G11的αN R37发生空间或不利的静电冲突。从C-open-apo到C-closed-GTP状态，NTSR1 ICL2与G11的接触百分比也从21%显著增加至44%，表明ICL2在G11相互作用中仍扮演角色。
通过结构比对探讨了为何G11缺乏类似Gi1的NC-closed-GTP中间态。一个潜在的障碍是Gα11的K33残基，在NC取向下它会指向受体ICL2的K17734.54，产生不利的静电相互作用。此外，受体TM5–ICL3–TM6穿过的αN–β2–β3环–α5区域在不同G蛋白间也存在显著的序列差异。比较中间态受体结合G蛋白区域的序列发现，主要亚型家族之间的序列变异远大于同一家族成员之间，这突出了这些区域在驱动GPCR–G蛋白中间态稳定性和偶联选择性方面的潜力。
鉴于G11在GTP活化通路中缺乏稳定的中间态，推测激活的G11从NTSR1释放的速度应显著快于Gi1。通过预稳态单分子荧光实验验证了这一假设：GTP诱导的NTSR1–Gi1和NTSR1–G11复合物解离的时间常数分别约为37秒和15秒，Gi1释放比G11慢约2.5倍。这一发现与时间分辨冷冻电镜分析结果相互印证。
先前研究发现，NTSR1的四个残基（ICL1的S93和L94、TM6基部的R2946.26、H8的H3738.52）能够选择性降低Gi1信号而非Gq信号。这些突变的选择性不能简单地用它们特异性地敲除Gi1而非G11的NC-open-apo状态来解释。通过分析中间态结构，可以更好地理解这些突变的作用机制。例如，在Gi1-C-closed-GTP状态中，NTSR1的R2946.26指向回缩的α5螺旋，并可能与α5螺旋上的D350形成盐桥；而在G11-C-closed-GTP状态中，由于受体旋转，R2946.26远离α5螺旋约5?，不太可能与等效的E353相互作用。这突显了α5螺旋序列（包括末端钩状结构）在G蛋白亚型选择性中的广泛作用。
Intermediates influence G protein selectivity
将NTSR1的结果与之前对μ-阿片受体（MOR）–Gi1复合物GTP诱导活化的研究进行比较，揭示了中间态观察及其表观稳定性的异同。NTSR1–Gi1存在两种高群体中间态（C-closed-GTP和NC-closed-GTP），而MOR–Gi1（与同等强效激动剂结合时）仅有一小部分颗粒同时具有闭合AHD和活性受体，且α5螺旋回缩和AHD闭合不完全。相反，完全激动剂（特别是超激动剂）结合的MOR–Gi1一旦AHD完全闭合，受体几乎完全与G蛋白脱离。
通过将MOR的活性结构比对到NTSR1的Gi1-C-closed-GTP和Gi1-NC-closed-GTP结构，可以识别出几个关键残基变化，这些变化主要集中于ICL2，会 destabilize MOR类似的中间态。例如，NTSR1 ICL2的F17434.51被MOR的V17534.51取代，会减弱两种状态下的疏水 packing；对于C-closed-GTP状态，MOR的D17934.55（对应NTSR1的T17834.55）会靠近Gi1的D193，产生不利的电荷排斥；此外，由于MOR的TM5明显更短，其TM5–ICL3–TM6区域无法形成与Gi1的αN–β2–β3环–α5的相互作用。分子动力学模拟表明，Gi1-NC-closed-GTP NTSR1复合物在多个2微秒轨迹中保持稳定，而假设的Gi1-NC-closed-GTP MOR复合物中的受体会旋转回更类似C的排列。
已有报道称，对于多个家族A GPCR，ICL2和ICL3序列对G蛋白亚型选择性贡献显著。基于结构发现，本研究构建了NTSR1与MOR的ICL2和ICL3嵌合体，并通过BRET实验检测激动剂诱导的Gβγ释放。与野生型NTSR1相比，NTSR1MOR-ICL2的最大Gβγ释放显著降低，且两种受体的ICL2交换均使Gi–Gβγ释放动力学减慢约50%。NTSR1MOR-ICL2对Gq最大信号的影响与Gi相似，但对其动力学的影响更为显著（减慢约82%）。NTSR1MOR-ICL3交换对Gi信号动力学的影响小于ICL2交换，对Gq信号的影响则更小。同时交换两个胞内环（NTSR1MOR-ICL2/3）几乎完全消除了Gq信号，但仍保留部分Gi信号。然而，将NTSR1的ICL2和ICL3同时引入MOR（MORNTSR1-ICL2/3）并未诱导出Gq信号，表明其他区域（如TM7–H8界面）也在信号传导中发挥作用。
研究还测试了NTSR1 ICL2几个关键位点
