大麻种子计数与形态计量分析方法比较：为种质资源管理与商品化分级标准建立提供高效工具 间隔符

《The Plant Phenome Journal》：Hemp seed counting and morphometric analysis method comparison

本文系统评估了手动计数、手动测量、自动计数仪（SEED_CNTR）和自动种子分析仪（SEED_ANA）四种大麻种子测量方法，旨在为建立大麻籽粒的商品化分级标准提供技术支持。研究表明，自动方法在效率与重复性上优势明显，可快速获取种子数量、宽度、长度、千粒重(TSW)和容重(TSTWT)等关键性状。研究还明确了种子大小在品种和产地间的显著差异，为种质库管理和育种工作提供了高效的自动化表型分析方案。 间隔符

　　

文章内容总结

引言

大麻是一种多用途作物，其种子富含油脂和蛋白质。自2022年以来，美国农业部农业研究局（USDA ARS）已收集了超过800份大麻种质资源。种子大小是重要的农艺性状，与其他作物的籽粒分级标准和幼苗在逆境下的活力密切相关。然而，关于大麻种子大小分布的信息有限，尚未建立统一的籽粒分级标准。为了建立公平、准确、可量化的标准以支持大麻籽粒的商品化，全面了解其种子形态性状的变异是必要前提。

评估种子大小的方法多种多样。过去二十年，通过计算机视觉方法进行的自动种子图像分析（例如使用平板扫描仪或相机）可以高效地每日测量数百个样品的种子长度、宽度和面积。诸如SmartGrain、SeedExtractor等开源软件，以及基于ImageJ的插件，都已开发用于批量处理种子图像。同时，结合近红外光谱的个体种子分析设备也已出现，机器学习技术正被整合以改进计数和性状测量。手动测量技术（如使用卡尺和精密天平）仍被广泛使用，筛分法也常用于根据孔径大小估算种子分布。

本研究旨在比较手工和自动种子计数与测量方法，以确定种子计数、大小和测量时间的变异；确定大麻种子形态计量分析和种质管理的高效方法；并报告多样性大麻种质的优先种子性状范围和汇总统计。

材料与方法

本研究的种子来自2022年在美国纽约州日内瓦种植的15份大麻种质。这些种质根据护照信息被分为亚洲、欧洲、高萜烯（HC）或野生等大类。种子在植株衰老时收获、干燥、脱粒、清洗并在4°C下储存。

研究采用了两种手动方法和两种自动方法处理相同体积（3.84 mL）的种子样品，每种方法进行三次技术重复。两种手动方法分别是：手动计数（HND_CNT）以及手动计数并测量（HND_MEA），后者需手动计数并对每10粒种子中的1粒使用数字卡尺测量长度和宽度。两种自动方法分别是：使用Seedburo 801 Count-a-Pak种子计数器（SEED_CNTR）计数，以及使用MARViN VisionLine种子分析仪（SEED_ANA）记录种子数量、宽度、长度、面积、圆度、长宽比、谷壳百分比（面积<2.0 mm²的物体）和测量时间。样品重量用于计算千粒重（TSW）和容重（TSTWT）。对于有足够种量的9份种质，还使用1.0 L和0.5 L的标准容器测量了容重，并与3.84 mL、8.5 mL等小体积估算值进行了比较。

数据分析采用JMP Pro软件。通过固定效应和混合模型检验测量方法、种质、技术重复、区组及其交互作用。通过多元分析生成性状间的皮尔逊相关系数，并使用Tukey’s HSD检验进行多重比较。

结果

方法比较

在种子计数方面，SEED_CNTR方法比SEED_ANA方法多计数2.7粒种子，而其他三种方法的计数结果无显著差异。在测量时间上，SEED_MEA（手动计数并测量）方法比SEED_ANA方法多花费431.6秒，是效率最低的方法。三种方法（SEED_CNTR、SEED_ANA和HND_CNT）的测量速度均低于1秒/粒，而SEED_MEA方法高达4.49秒/粒。四种计数方法的结果呈高度正相关。

通过回归方程分析，当种子数少于83粒时，手动计数（HND_CNT）最快；种子数在83至180粒之间时，SEED_ANA最快；种子数超过180粒时，SEED_CNTR最快。

在种子大小测量上，HND_MEA方法测得的种子长度比SEED_ANA方法短0.11毫米，但两种方法测得的种子宽度无显著差异。值得注意的是，HND_MEA方法的测量结果在技术重复间存在显著差异，这表明手动测量的人为误差和疲劳因素会影响其重复性。

在容重测量上，对9份种质使用四种不同体积测量的结果显示，种质间存在显著差异，但测量体积、技术重复及其交互作用对结果无显著影响。这表明，即使使用小体积（如3.84 mL）样品，只要操作规范，也能可靠地估算大麻种子的容重。

种质种子性状分析

由于手动测量重复性不佳，后续的种质间比较主要基于SEED_ANA数据。种子宽度、长度、千粒重和面积之间呈高度正相关。容重与千粒重、种子宽度、长度和面积的相关性较弱甚至为负。

在15份大麻种质中，种子性状存在显著差异。G 33369（云麻）具有最大的种子宽度、长度、面积和千粒重。而最小的种子尺寸出现在美国野生种质G 33260（达科他沙山(L)）中。亚洲来源的种质种子最大，美国野生种质的种子最小。高萜烯（HC）类种质的种子大小居中，但谷壳含量最高。

讨论

本研究表明，手动计数是成本最低、效率最高的方法，适用于少于83粒的小种子批。当种子数量较多时，自动化方法在速度和重复性上优势显著。手动测量虽然设备简单，但耗时且易受人为误差和疲劳影响，其重复性不如自动化方法。自动化方法（如种子分析仪）虽然设备昂贵，但能提供高通量、可重复的个体种子形态数据，并能计算种子批内的分布情况，有助于评估种子均匀度。

研究也指出了当前自动化方法面临的挑战，例如，种子计数器无法区分种子和谷壳，导致计数偏高。种子分析仪通过面积阈值（<2.0 mm²）过滤谷壳，效果更佳。理想的种子分析仪应具备快速上样、可靠计数与测量、整合光谱信息与谷壳检测、可编程分选以及成本适中等特点。

本研究发现，尽管供试种质为异交群体，但种质内的种子大小相对均匀（种子宽度的变异系数为12.4%），这表明异交对种子大小变异的贡献可能有限。大麻种子的容重在41.9至56.3 kg hL^-1之间，介于油菜（canola）和大豆之间。未来大麻育种的一个重要目标可能是培育容重更高的致密种子，以使其更接近其他谷类或油料作物的商品标准。

结论

本研究验证了自动化种子计数与测量仪器在种质资源管理、研究和育种中生成高质量数据的实用性和可重复性。对于少于83粒的小种子批，手动计数是一种经济高效的方法，并能有效剔除杂质。然而，要获取个体种子测量数据和形态分布信息，自动化方法是更高效的选择。本研究为大麻种子大小特征提供了详实的数据，指出其大小介于油菜和大豆之间，并发现亚洲来源的种质具有更大的种子尺寸和更低的杂质率。自动化种子分析将极大地促进未来大麻种质保存、籽粒分级和育种工作。