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提出基于分布特征的数据处理方法（DFDP），通过将微孔阵列划分为子阵列并利用线性分布关系优化计算，有效减少微球聚集、气泡等干扰因素对荧光滴液比例分析的影响，在35-1000 aM浓度范围内使检测稳定性提升达90%，且检测下限（0.48 aM）与传统方法接近。
徐宣伟|胡彦军|敖宇|乔宇|戴群|牛博文|范国芳
教育部重点实验室（全光网络与先进电信网络），北京交通大学光波技术研究所，中国北京100044
摘要
背景
基于表面成像的数字珠子分析（DBA）因其极高的灵敏度和多重检测优势而被广泛用于低浓度蛋白质的识别。然而，来自碎屑（如珠子聚集、气泡和残留水等）的错误信号会影响结果的准确性和稳定性。在这里，我们提出了一种基于分布特征的数据处理（DFDP）方法，该方法将微孔阵列视为多个子阵列的组合，并通过相同微孔阵列数据的线性分布关系来减少错误信号的影响。
结果
以链霉亲和素-β-半乳糖苷酶（SβG）的数字计数为例，评估了DFDP的效果。结果显示，在0–10 aM浓度范围内，DFDP对荧光滴比例的稳定性与传统方法相当；而在35–1000 aM浓度范围内，DFDP的稳定性提高了高达90%。此外，DFDP表现出出色的错误数据集校正能力，其检测限（0.48 aM）与传统方法（0.47 aM）非常接近，证明了其可靠性。
意义
DFDP在图像分析之后进行计算，专注于改进荧光滴比例的计算方法，从而进一步减少碎屑对图像的影响，提高DBA的稳定性和准确性。
引言
DBA由于在生物研究、药物开发、临床诊断等领域的高灵敏度而被广泛用于蛋白质检测[1]、[2]、[3]、[4]、[5]，因为蛋白质是生物体中最重要的分子之一，且大多数蛋白质的浓度较低[3]。在DBA中，使用过量的珠子来捕获和标记低浓度的蛋白质，这些珠子可分为三种状态：未标记、单标记和多标记[6]。2011年，提出了每个珠子上酶的平均数量（AEB）的概念，并将其应用于DBA[7]。基于AEB的DBA方法主要分为两类[8]：表面成像[9]、[10]和流式细胞术[11]、[12]。
表面成像DBA方法因其多重检测优势和增强的灵敏度而越来越受到重视。该方法通过明场和荧光图像的成像分析算法，获得至少带有一个标签的珠子比例[6]。然而，实验条件、操作程序和试剂条件可能导致图像中不可避免的背景信号和碎屑（如珠子聚集、气泡和残留水等）[13]、[14]，这可能导致对荧光滴数量或加载珠子数量的错误分析，从而影响检测结果的准确性和稳定性以及设备的固有检测限（LOD）。为了减少碎屑的影响，传统方法[13]、[14]、[15]、[16]使用宽视场（FOV）荧光显微镜对整个微孔阵列进行成像，然后使用图像分析算法来识别并减少图像中的碎屑影响[17]、[18]、[19]。然而，这种方法在消除碎屑影响方面的能力有限，需要进一步改进。
在本文中，我们提出了一种基于分布特征的数据处理（DFDP）方法，这是一种新的计算方法，可以进一步减少图像分析算法后碎屑的影响。该方法利用窄视场成像或随机选择区域将微孔阵列视为多个子阵列的组合，并依赖于同一阵列数据的线性分布关系来实现相互优化。因此，该方法可以利用正常子阵列的数据来校正含有碎屑的子阵列的数据，从而减少错误信号的影响，并获得拟合斜率。拟合斜率被用作荧光滴比例与加载珠子总数的比率，并通过加权求和进一步校正，以提高宽浓度范围内的稳定性。
为了研究DFDP的效果，我们将DFDP方法与传统方法（荧光滴与加载珠子总数的比率）进行了比较，对链霉亲和素-β-半乳糖苷酶（SβG）的数字计数数据进行了分析。评估了两种方法的测量变异系数（CV）和设备的固有LOD。
方法描述
所提出的DFDP方法如图1所示。我们以最常用的表面成像方法之一——数字ELISA[20]、[21]、[22]、[23]为例，详细说明了每个模块的具体作用和DFDP的计算过程。
实验
准备了SβG的数字计数实验，以探索所提出的DFDP方法。
结果与讨论
为了评估所提出的DFDP方法，我们首先使用图像分析算法检测了链霉亲和素与报告酶β-半乳糖苷酶（SβG）的结合物，获得了二维数据集。接下来，将数据集输入校正模块以获得荧光滴比例（f_on）。然后根据IQR对数据集进行过滤，再通过OLS回归分析得到方程（3）的线性关系函数。之后，将方程（3）和数据集进行联合分析。
结论
在本文中，我们提出了一种新的方法来计算荧光滴比例，即基于分布特征的数据处理（DFDP），以减少图像中碎屑对结果的影响，从而提高DBA的稳定性和准确性。对于高浓度样本（35–1000 aM），DFDP利用相同微孔阵列数据的线性分布关系，并使用经典的OLS回归模型实现数据点之间的相互优化。
CRediT作者贡献声明
牛博文：撰写——初稿、验证、软件开发、数据管理。
戴群：撰写——审稿与编辑、监督、软件开发。
乔宇：可视化处理、软件开发、数据分析。
敖宇：可视化处理、软件开发、数据分析。
范国芳：撰写——审稿与编辑、验证、软件开发、数据分析、方法学研究、数据管理。
胡彦军：撰写——审稿与编辑、监督、方法学研究、数据分析。
徐宣伟：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、软件开发。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢
中国国家重点研发计划（2021YFF0600905）的支持。
徐宣伟1999年出生于中国河北。他目前在中国北京交通大学攻读博士学位。他的研究兴趣包括光学MEMS、生物传感器和光波导。
