基于硫化氢激活的近红外探针，通过双模态荧光和质谱成像技术准确区分可逆性和不可逆性急性肝损伤

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Hydrogen Sulfide Activatable NIR Probe for Accurate Distinction of Reversible and Irreversible Acute Liver Injury via Dual-modality Fluorescence and Mass Spectrometry Imaging

基于H2S激活的荧光探针CySO3NO2结合近红外荧光成像与质谱成像技术，实现急性肝损伤（ALI）中可逆与不可逆损伤的动态区分与机制研究。摘要：

张金龙|张彦霞|刘硕|黄飞|刘继飞|张振昌|裴东|海俊

中国科学院兰州化学物理研究所西北植物资源化学国家重点实验室与甘肃省天然药物化学国家重点实验室，中国甘肃省兰州市730000

摘要

监测急性肝损伤（ALI）期间的微环境变化对于区分可逆性和不可逆性组织损伤至关重要。在这里，我们开发了一种H₂S激活的小分子荧光探针CySO₃NO₂，它通过结合近红外（NIR）荧光和质谱成像（MSI）技术，实现了对体内生化及结构变化的时序可视化。CySO₃NO₂对硫化氢（H₂S）具有高选择性和敏感性，能够进行肝脏氧化还原状态的时间分辨时空追踪。在可逆性肝损伤模型中，激活产物CySO₃OH产生的强烈荧光和MSI信号主要局限于肝脏区域，并且在药物治疗后这些信号减弱，表明肝脏功能正在恢复。相比之下，在CCl₄诱导的不可逆性损伤模型中，CySO₃OH信号重新分布到肾脏，表明肝脏功能衰竭且探针保留能力受损。这些结果表明CySO₃NO₂是一种强大的双模态成像工具，可用于准确区分可逆性和不可逆性ALI。这一策略为肝病的早期诊断、机制研究和治疗评估提供了有前景的平台。

引言

急性肝损伤（ALI）是一种复杂的病理状态，由多种因素引发，包括药物过量、酒精滥用、免疫诱导以及碳四氯化物（CCl₄）等肝毒性化学物质[1]。尽管早期ALI可能表现出相似的生化特征，但其进展具有高度不确定性，从及时干预后病情改善到发展为不可逆性损伤（包括坏死和纤维化）都有可能[2]，[3]。准确区分可逆性和不可逆性ALI对于指导临床决策（包括治疗策略和肝移植时机）至关重要[4]。

目前常用的临床诊断方法，如血清转氨酶检测和放射成像，对疾病进展过程中潜在的生化变化及微环境的时间依赖性变化了解有限[5]，[6]。这些方法通常缺乏分子特异性和空间分辨率，难以及时捕捉病理生理事件的早期信号，从而限制了肝损伤的早期诊断和准确评估。相比之下，基于特定生物标志物识别的荧光探针技术在肝损伤的早期诊断中显示出巨大潜力。这些探针可以实时监测关键生理指标的变化，例如氧化还原失衡[7]、组织粘度变化[9]以及活性硫物种（RSS）的波动[10]，[11]。值得注意的是，硫化氢（H₂S）[12]作为一种重要的气体信号分子，在肝脏炎症、细胞保护和组织损伤修复中起着关键的调节作用；因此，其水平的变化可以作为反映肝损伤早期病理过程的重要分子信号[13]。

然而，单独使用荧光成像受到穿透深度有限、光漂白和组织自荧光的影响，这些因素共同降低了体内深部器官评估的定量可靠性[14]，[15]，[16]，[17]。相比之下，质谱成像（MSI）能够无标记地高分辨率地绘制内源性代谢物和外源性小分子的空间分布图，无需受荧光的光学限制[18]。重要的是，虽然荧光成像能够实现体内H₂S变化的时序和高灵敏度监测，但它受到光学衰减和组织自荧光的影响。而MSI则能够在体外无标记地、分子特异性地和高分辨率地绘制激活探针产物和内源性代谢物的空间分布图。因此，结合这两种成像方法可以在统一框架内实现时间功能读数和分子层面的验证[19]，[20]，非常适合捕捉ALI的生化复杂性并探索损伤的可逆性。

在这里，我们报道了一种H₂S激活的小分子探针CySO₃NO₂，它将近红外（NIR）荧光成像与基质辅助激光解吸/电离质谱（MSI）结合用于ALI评估。结构上，CySO₃NO₂基于半花青素类支架，并包含一个对H₂S响应的触发基团，该基团会发生选择性亲核取代反应，释放出具有显著增强NIR发射的荧光产物CySO₃OH[21]。值得注意的是，这种设计实现了跨模态的统一分子读数：相同的激活产物（CySO₃OH）可以通过体内NIR荧光进行追踪，并通过体外MSI独立可视化，为探针激活和组织分布提供了正交且直接可比较的证据（图1）。

我们假设这种双模态、微环境响应的化学工具可以通过同时报告与H₂S相关的微环境变化和验证与肝脏功能状态相关的空间重分布模式，来实现对可逆性和不可逆性ALI的分子区分。因此，这项工作为功能性肝脏诊断和ALI微环境时间依赖性变化的机制研究提供了双模态成像框架。

化合物CySO₃NO₂的合成

将CySO₃OH（625.0 mg，1.0 mmol）、1-氟-2,4-二硝基苯（205.0 mg，1.1 mmol）和K₂CO₃（207.0 mg，1.5 mmol）加入干燥的DMF中，在50.0°C下搅拌。反应完成后（通过TLC监测，约0.5~1.0小时），用CH₂Cl₂稀释并用水洗涤3次。有机相用无水Na₂SO₄干燥，然后使用CH₂Cl₂:CH₃OH（100:1~20:1，v/v）作为洗脱液进行柱层析纯化，得到紫红色固体CySO₃NO₂（214.0 mg，产率为31%）。¹H NMR（600 MHz，DMSO-d

光谱特性和传感机制的验证

系统地评估了CySO₃NO₂对硫化氢（H₂S）的光物理响应。与H₂S反应后，在680 nm处出现一个新的吸收带，并在640 nm处有轻微增强（图S1A），表明发生了结构转变并形成了新的发色团。相应地，CySO₃NO₂在705 nm处的荧光发射显著增强，大约是反应前的四倍（图S1B）。

结论

通过结合荧光成像的分子灵敏度和质谱成像的空间精度，本研究确立了CySO₃NO₂作为一种强大且高度特异性的化学探针，能够以出色的时空分辨率区分可逆性和不可逆性肝损伤。该探针对内源性H₂S具有出色的响应性，并能够实现肝脏功能状态的时序可视化。在可逆性损伤模型中，CySO₃NO₂

CRediT作者贡献声明

张彦霞：研究、数据分析。刘硕：撰写——原始草稿。黄飞：可视化。张振昌：资源提供。刘继飞：数据分析。裴东：资金筹集。海俊：可视化、项目管理。张金龙：撰写——原始草稿、数据管理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了甘肃省科技计划（24JRRA063）、兰州市城关区重大科技计划（2025KJZD0006）、甘肃省科技厅“十五五”期间重点培养项目（编号KCP155B08）、甘肃省重点研发计划（25YFFA033）、甘肃省基础创新研究群体科学基金（25JRRA469）、甘肃省重点研发计划（GSHZJH 12-2025-02）以及宁夏自治区重点研发计划（2024BBF02008）的支持。

张金龙在中国科学院兰州化学物理研究所（LICP, CAS）接受了培训。他的研究方向是可激活的小分子荧光探针和多模态成像技术在生物医学应用中的研究，特别关注活性硫物种的微环境响应传感和体内疾病评估。