一种基于细胞机制的计算方法用于评估肉毒杆菌神经毒素A的效力，能够实现透明、准确的效力评估以及不同检测方法之间的结果一致性

细胞毒性评估：基于计算模型的跨试验potency和谐性验证与方差分析

　　

埃克拉姆·拉赫曼（Eqram Rahman）| 戈拉姆·萨克莱恩（Golam Saklayen）| 帕里尼塔·拉奥（Parinitha Rao）| 亚历山大·纳西夫（Alexander Nassif）| 约翰·H·约瑟夫（John H. Joseph）| 威廉·理查德·韦伯（William Richard Webb）

研究与创新中心，创新美学，伦敦，英国

摘要

基于细胞的效力测定已经取代了传统的A型肉毒杆菌神经毒素（BoNT/A）的LD50测试，然而商业平台仍然具有专有性，这限制了跨产品的透明比较。我们开发了一种基于机制的计算细胞效力测定方法，该方法完全基于已发布的onabotulinumtoxinA SiMa CBPA的验证数据进行了校准。毒素-细胞相互作用模型再现了经过验证的分析范围：模拟的EC50值集中在3.9–4.4 U/mL之间（平均4.11），中位斜率为1.08，信号限与报告的动态范围一致。批次内的变异性对应于6.8–7.2%的CV，批次间的变异性对应于8.9–9.4%的CV。出现了一个特征性的方差分布，即在名义效力附近分散最小，而在测定限附近不确定性增加。

为了评估可转移性，我们保持细胞内机制层不变，同时使用已发布的abobotulinumtoxinA BoCell报告基因测定的特征重新参数化观察模型。在模拟的效力范围为50–200%的情况下，EC50分布和斜率范围与已发布的数据相匹配，SiMa模拟的效力RMSE为3.7–4.8%，报告基因模拟的效力RMSE为4.9–6.1%。跨测定的协调性表现出很强的一致性：Deming斜率为1.03（95% CI 1.00–1.06），Passing–Bablok斜率为1.04，Bland–Altman偏差为1.8%，一致性相关系数为0.947。

通过引入探索性的Cell2Sentence嵌入技术，RMSE降低了15–25%，并揭示了批次和运行水平上的可解释的方差贡献。这种基于机制的、经过跨测定验证的框架提供了一个透明的计算机平台，用于测定优化和稳健性分析。

引言

肉毒杆菌神经毒素（BoNT）是已知最有效的生物制剂之一，有七种已确定的血清型，它们具有共同的作用机制，包括与外周胆碱能神经元结合、内化以及切割对可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE），后者对神经递质的释放至关重要（Bellows和Jankovic，2020；Dhaked等人，2010；Dressler和Adib Saberi，2005；Schantz和Johnson，1997）。这些特性使得A型肉毒杆菌毒素能够产生可逆的化学去神经作用，这是其广泛用于治疗和美容应用的基础。鉴于剂量误差范围很小以及批次间一致性的重要性，准确的效力测定对于产品安全和监管监督至关重要（Dashtipour和Pedouim，2016；Ferrari等人，2018；Rosales等人，2006）。

几十年来，效力测试一直依赖于小鼠致死剂量50%（LD50）测定，这是历史上的监管参考方法。然而，LD50受到高生物变异性的限制，通量低，成本高，并且与基于致死性的测试相关的伦理问题也很多。随着全球对3R原则的日益重视，向非动物替代方法的转变正在加速，特别是随着肉毒杆菌毒素产品市场的扩大（Hobbs等人，2019；Pellett，2012；Rasetti-Escargueil和Popoff，2021）。因此，监管期望推动了基于体外效力的测定的更多采用（Pellett等人，2015；Wang等人，2025）。

基于细胞的效力测定（CBPAs）已成为最有前景的替代方法，因为它们可以在神经元或类神经元细胞中再现BoNT作用的关键细胞步骤，包括结合、摄取、转运和切割SNARE底物，如突触体相关蛋白25（SNAP25）或突触短蛋白-2（VAMP2）（Duchesne de Lamotte等人，2021；Rasetti-Escargueil和Popoff，2022）。一个关键里程碑是开发了一种基于人类神经母细胞瘤SiMa的BoNT/A CBPA，该方法通过电化学发光测量SNAP25(197)的细胞内积累。这种测定达到了与小鼠生物测定相当的灵敏度，并已用于onabotulinumtoxinA原料药和成品的效力测试（Fernández-Salas等人，2012）。在此基础上，还开发了其他BoNT/A CBPAs，包括将SNAP25切割与分泌或细胞内报告基因偶联的报告基因测定，以及更接近人类运动神经元的hiPSC衍生神经元系统（Rasetti-Escargueil和Popoff，2022）。基于细胞的测定也已扩展到其他血清型及相关检测问题，例如基于细胞的BoNT/A和B活性的报告基因释放测定（Rosen等人，2016；Whitemarsh等人，2013）。

目前的CBPA格局是碎片化的，且高度特定于测定方法。各种方法紧密依赖于特定的细胞系、分化方案、检测化学方法和分析流程，并且通常受到知识产权的保护，这限制了透明度和可转移性。同时，每种商业BoNT/A产品（例如AbobotulinumtoxinA [(ABO)，Dysport?；Medicis Aesthetics，亚利桑那州斯科茨代尔；Azzalure，Galderma Laboratories，瑞士洛桑]，DaxibotulinumtoxinA [(DAXI) DAXXIFY?，Revance Therapeutics，美国田纳西州纳什维尔]，IncobotulinumtoxinA [(INCO) Xeomin?/Bocouture?，Merz Pharmaceuticals GmbH，德国法兰克福]，LetibotulinumtoxinA [(Letibo) Letybo?，Botulax?；Hugel，韩国春川]，OnabotulinumtoxinA [(ONA) Botox?/Vistabel?，Allergan，美国加利福尼亚州尔湾]，PrabotulinumtoxinA [(PRABO) Jeuveau?，Evolus，美国纽波特海滩]）都使用自己的参考标准和单位定义，这使得跨产品的效力比较和临床剂量转换变得复杂（Dressler和Johnson，2022）。

最近的研究表明，设计良好的CBPAs可以实现与mLD50测定的等效性。例如，对ONA的多批次等效性研究表明，基于SiMa的CBPA和小鼠生物测定得出的效力估计在统计上相当，CBPA显示出更高的精度和更低的方差（Yang等人，2024）。对于ABO，基于荧光的BoCell?测定也显示出了准确性、重复性和在mLD50测定接受范围内的中等精度，并且在多个生产批次中与历史效力方法高度一致（Fonfria等人，2023）。

概率潜变量模型、多输出观察框架和高维细胞状态嵌入现在被广泛用于整合异构测量、推断未观察到的生物量，并在假设性扰动下模拟复杂系统的行为（Chen等人，2025；Kopf和Claassen，2021；Rood等人，2024）。在单细胞领域，将转录组、表观基因组和蛋白质读数整合到共享潜在空间的方法允许将细胞状态表示为连续嵌入，这些嵌入可以与功能输出定量关联（He等人，2024；Jackson和Vogel，2022；Lee和Li，2024）。同时，基于模型的测定优化框架表明，计算模拟可以用来探索设计变量，如几何形状、流动和反应条件，并从有限的实验数据中加速高性能测定配置的收敛（Tay等人，2023）。

然而，这些计算策略尚未系统地应用于肉毒杆菌神经毒素的效力评估。目前的BoNT CBPAs几乎完全使用标准非线性回归模型分析单个剂量响应曲线，将效力视为特定于测定的总结值（例如EC50或相对于参考批次的相对效力），而不是可以跨测定、模式和条件联合推断的潜在生物属性（Dressler和Johnson，2022）。

目前没有公开描述的框架将效力定义为独立于测定的潜在变量，将包括基于细胞的、体内和高维细胞特征在内的多种读数作为该变量的观察函数，支持虚拟实验以评估精度和偏差，并明确表示细胞状态以实现生物学解释。因此，效力仍然是一个特定于测定且不透明的指标，而不是一个透明且可生物解释的属性，限制了跨产品的比较和严格的测定开发。

本研究的目的是四方面的。首先，使用公开可用的SiMa验证数据完全校准一个基于计算机的细胞效力测定（Yang等人，2024）。其次，创建一个透明且可重复的框架，以捕捉该经过验证的测定的剂量响应特性、变异性和精度界限。第三，将校准后的模型应用于使用不同神经元系统和报告基因机制的独立ABO CBPA数据集（Fonfria等人，2023），以评估跨测定的泛化能力。第四，证明该模型为协调不同产品和测定之间的效力解释提供了定量基础，从而解决了长期存在的透明度、测定孤岛和非可比单位系统的问题。最后，该框架依赖于关于受体可用性、细胞内运输和噪声结构的一组明确定义的生物学和统计假设。

章节片段

概念框架和研究设计

指导该模型的核心假设是，BoNT/A批次的内在生物效力可以表示为一个连续的潜在变量，记为π?，所有经过验证的BoNT/A测定都可以理解为作用于这一相同潜在属性的噪声观测函数。研究设计分为三个连续阶段，以确保严格的开发、验证和跨测定评估。

第一阶段专注于机制模型的开发和校准。

结果

CCBPA生成了一个多层次的定量数据集，反映了内在效力恢复、特定于测定的信号形态、跨测定协调性以及模拟的细胞异质性的影响。结果首先验证了协调性的前提，然后评估了整个效力范围内的准确性、精度、系统测定行为和稳定性。

讨论

本研究表明，仅使用公开可用的分析参数就可以通过计算方法再现已建立的ONA效力测定的行为，当应用于独立ABO报告基因测定的观察特性时，同一系统可以生成一致的效力估计。据我们所知，这是第一个基于机制的BoNT/A产品的计算细胞效力测定，也是第一个展示单一潜在变量的

结论

这项工作表明，可以使用公开可用的测定参数再现经过验证的onabotulinumtoxinA细胞效力测定的行为，并且当应用于AbobotulinumtoxinA报告基因测定时，得到的模拟结果是一致的。该模型反映了传统CBPAs的关键特征，包括它们的分子和分析限制，并展示了如何通过Cell2Sentence嵌入等结构化的变异性影响效力

伦理批准和参与同意

不适用。

出版同意

不适用。

数据和材料的可用性

用于支持结论的研究数据可根据请求从相应作者处获得。

伦理声明

本研究没有涉及人类参与者、动物实验或使用可识别患者的数据。所有研究仅通过计算机建模和文献支持的参数进行。因此，不需要伦理批准和知情同意。

本研究没有进行任何临床程序，也没有招募、联系或让任何人类受试者接受任何干预。本研究中生成的合成患者模型仅用于

资金来源

本研究没有从公共、商业或非营利部门的资助机构获得任何特定资助。

CRediT作者贡献声明

埃克拉姆·拉赫曼（Eqram Rahman）：概念化、数据管理、正式分析、调查、方法论、资源、软件、验证、可视化、初稿撰写、审稿和编辑。戈拉姆·萨克莱恩（Golam Saklayen）：数据管理、正式分析、软件、验证、可视化、初稿撰写、审稿和编辑。帕里尼塔·拉奥（Parinitha Rao）：数据管理、资源、验证、可视化、初稿撰写、审稿和编辑。亚历山大·纳西夫（Alexander Nassif）：方法论、撰写——

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

作者是该期刊的编辑委员会成员/主编/副主编/客座编辑，未参与编辑审查或决定发表本文。

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：

致谢

作者感谢Korim Uddin在AesthetiSIM?工作流程中协助数据提取、预处理和模型集成任务。他的职责仅限于数据管理和计算验证，不涉及假设制定或结果解释。