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优化动物福利的蛇毒血清效力检测方案验证：通过 tramadol镇痛和6小时终点观察替代传统48小时流程，评估对LD50和ED50测定的影响，结果显示两者等效且显著减少动物痛苦，验证了线性（R2=0.986）、准确度（84-119%）和中间精度（最大RSD11.7%）等关键指标，支持该方案在常规抗蛇毒血清检测中的采用。
加布里埃拉·索拉诺（Gabriela Solano）|吉娜·杜兰（Gina Durán）|莫伦·维拉尔塔（Mauren Villalta）|保拉·桑切斯（Paola Sánchez）|阿德里安娜·桑切斯（Adriana Sánchez）|阿隆·戈麦斯（Aarón Gómez）|吉列尔莫·莱昂（Guillermo León）
哥斯达黎加大学微生物学系克洛多米罗·皮卡多研究所（Instituto Clodomiro Picado），圣何塞（San José），哥斯达黎加
摘要
在蛇类抗毒血清的质量控制中，提高小鼠致死中和试验中的动物福利是可取的，但任何改进都必须保持分析的可靠性。我们评估了一种改进后的方案（包括使用曲马多（tramadol，50 mg/kg）进行镇痛处理以及缩短观察时间至6小时）对测定半数致死剂量（LD50）和半数有效剂量（ED50）的影响，并与标准方案（不使用镇痛剂且观察时间为48小时）进行了比较。在6小时时测得的LD50值略高于48小时时的值，但只有某种抗毒血清显示出统计学上的显著差异。当使用基于每个观察时间点对应的LD50值来确定ED50时，在代表三种产品、多种抗毒血清、两种给药途径和两个不同小鼠体重范围? 22批抗毒血清样本中，未观察到6小时和48小时测得的ED50值之间存在显著差异。标准方案和改进方案下获得的ED50值显示出强烈的相关性。改进方案还满足了分析验证标准，证明了足够的线性（R2 = 0.986）、准确性（回收率84–119%）和中等精度（最大RSD为11.7%）。这些结果表明，改进方案能够在减少动物疼痛和痛苦的同时提供与标准方案相当的有效性估计值，支持其在常规抗毒血清效力测试中的采用。
引言
蛇咬伤中毒仍然是热带地区的一个主要公共卫生问题，尤其是在资源匮乏的环境中，它会导致相当高的发病率、死亡率和长期残疾（Afroz等人，2024年）。尽管一直在努力开发辅助或替代疗法，但动物来源的抗毒血清的肠外给药仍然是唯一经过科学验证且在临床上有效的蛇咬伤治疗方法（世界卫生组织，2017年）。
在这种背景下，小鼠致死中和试验仍然是评估抗毒血清效力的金标准（世界卫生组织，2017年），其分析性能已经得到了正式的表征（索拉诺等人，2010年）。因此，该试验在全球的研究实验室、工业质量控制项目和监管决策中得到了广泛应用。
小鼠致死中和试验涉及给予致命剂量的抗毒血清，根据所测试的抗毒血清的不同，会导致动物因呼吸衰竭、瘫痪、凝血功能障碍、出血、坏死或器官功能障碍而遭受巨大痛苦（Bittenbinder等人，2024年）。这些担忧促使人们开发和验证符合3R原则（替代、减少和优化；Gutiérrez等人，2021年）的改进体内和体外替代方法。
近年来，已经提出了一些改进措施来减少小鼠致死试验中的疼痛和痛苦。这些措施包括使用镇痛剂（Harris等人，2013年；Gutiérrez和Herrera，2014年；Chacón等人，2015年；Herrera等人，2018年）以及缩短观察时间，从而减少了动物的疼痛和痛苦（Durán等人，2021年；Pereira-Júnior等人，2025年）。在评估的镇痛剂中，曲马多在小鼠中显示出约2–6小时的临床相关镇痛效果（Herrera等人，2018年），这一时间范围支持将观察时间缩短至6小时作为对传统48小时方案的伦理合理改进。
虽然这些改进措施具有明显的伦理优势，但它们也可能影响效力测定的关键分析属性。理论上，镇痛剂可能会改变抗毒血清的毒性或效力（Gutiérrez等人，2021年），而缩短的观察期可能会低估延迟的致死事件。因此，在将这些改进措施纳入常规质量控制框架之前，必须确定它们是否会影响半数致死剂量（LD50）和半数有效剂量（ED50）的测定结果。
本研究评估了两种动物福利改进措施——曲马多镇痛和缩短观察时间至6小时——对小鼠致死中和试验分析性能的影响。为此，我们比较了标准方案（不使用镇痛剂且观察时间为48小时）和改进方案（使用曲马多预处理且观察时间为6小时）下获得的LD50和ED50值，并对改进方案进行了分析验证，包括线性、准确性和中等精度。我们的目标是确定这些改进措施是否可以在不损害抗毒血清效力测试所需科学严谨性的前提下被采用。
实验动物使用伦理
实验室动物使用的伦理
本研究中的所有实验程序均经过了哥斯达黎加大学实验室动物护理和使用机构委员会（CICUA）的审查和批准（方案编号82-08和39-20），并遵循了《涉及动物的生物医学研究国际指导原则》（CIOMS等人，1986年）。CD-1品系的小鼠来自克洛多米罗·皮卡多研究所的生物实验室，并饲养在Tecniplast Eurostandard Type II 1264C笼子中。
镇痛和缩短观察时间对LD50测定的影响
为了评估动物福利改进措施是否会影响抗毒血清毒性的估计，我们比较了使用标准方案和改进方案获得的LD50值。在两种条件下，对具有不同毒理特性的多种蛇类抗毒血清进行了LD50的测定（表1）。
通常情况下，6小时时计算的LD50值高于48小时时的值。这种趋势是预期之中的，因为缩短的观察时间会减少...
伦理声明
本手稿呈现了一项遵循科学伦理标准进行的实验研究，包括实验动物的使用和护理。本研究中使用的所有程序均获得了哥斯达黎加大学实验室动物护理和使用机构委员会（CICUA）的批准（文件编号82-08），并符合《涉及动物的生物医学研究国际指导原则》（CIOMS等人，1986年）。本研究进行的大多数实验...
关于撰写过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本手稿的过程中，作者使用了ChatGPT（OpenAI）来协助语言润色、提高清晰度以及优化某些部分的结构。该工具未用于生成或修改科学数据、进行统计分析或得出结论。所有由AI辅助生成的文本均经过了作者的彻底审查、验证和编辑，作者对内容、科学准确性和完整性负全责。
CRediT作者贡献声明
加布里埃拉·索拉诺（Gabriela Solano）：概念化、数据分析、研究、初稿撰写、审阅与编辑。吉娜·杜兰（Gina Durán）：数据分析、研究方法、撰写、审阅与编辑。莫伦·维拉尔塔（Mauren Villalta）：数据分析、撰写、审阅与编辑。保拉·桑切斯（Paola Sánchez）：数据分析、撰写、审阅与编辑。阿德里安娜·桑切斯（Adriana Sánchez）：数据分析、撰写、审阅与编辑。阿隆·戈麦斯（Aarón Gómez）：数据分析、研究、撰写、审阅与编辑。吉列尔莫·莱昂（Guillermo León）：数据分析
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了Wellcome Trust [参考编号220517]和哥斯达黎加大学研究副校长办公室 [项目编号741-A0-804和741-C0-523]的支持。作者感谢克洛多米罗·皮卡多研究所的Jorge Gómez、Alexander Vargas和Orlando Morales以及其他同事在所有动物实验中的合作；感谢José María Gutiérrez博士对手稿的宝贵意见；以及Andrés Hernández在图表制作方面的支持。
