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大豆异黄酮染料木苷通过抑制HMGB1释放及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路减轻肝缺血再灌注损伤，降低血清AST/ALT水平，改善肝组织病理损伤，其机制与调节Bax/Bcl-2蛋白表达相关，体外实验验证了细胞保护作用。
李尚林|胡新月|严学强|彭飞|秦新科|刘欣|赵光远
武汉儿童医院普通外科，同济医学院，华中科技大学，武汉，430015，中国
摘要
大豆异黄酮染料木黄酮已被证明可以减轻脑和心肌的缺血-再灌注损伤。然而，其对肝脏缺血-再灌注损伤（HIRI）的潜在保护作用仍不清楚。本研究旨在探讨染料木黄酮在HIRI中的保护作用并阐明其机制。我们在雄性C57BL/6小鼠中建立了HIRI模型，并在建模前3天开始腹腔注射染料木黄酮。通过测量血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平来评估肝脏损伤的程度。通过HE染色评估肝脏组织的病理变化，使用TUNEL检测方法检测肝细胞凋亡。免疫组化用于分析高迁移率组蛋白1（HMGB1）的转位。Western blotting用于定量检测肝脏组织中BCL-2相关X蛋白（Bax）、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、TLR4（Toll样受体4）、髓系分化因子88（MyD88）和磷酸化p65（p-p65）的蛋白表达水平。实时定量PCR和酶联免疫吸附测定（ELISA）分别用于检测肝脏组织和血清中的促炎细胞因子水平。为了验证染料木黄酮是否通过抑制HMGB1的释放来发挥保护作用，在再灌注后给予外源性HMGB1。在体外实验中，AML-12细胞系受到氯化钴（CoCl2）诱导的细胞死亡，通过免疫荧光和Western blotting分析HMGB1的核质转位。结果表明，染料木黄酮处理显著降低了血清AST和ALT水平，改善了肝脏组织的病理损伤，抑制了HMGB1的释放，并减少了促炎细胞因子的产生。在机制上，染料木黄酮下调了促凋亡蛋白Bax的表达，同时上调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。它还抑制了HMGB1的核质转位，并降低了TLR4、MyD88和p-NF-κB的蛋白表达水平。外源性HMGB1部分逆转了染料木黄酮对HIRI的保护作用。体外实验证实，染料木黄酮减轻了CoCl2诱导的AML-12细胞死亡并抑制了HMGB1的核质转位。总之，染料木黄酮通过调节HMGB1-TLR4/MyD88/NF-κB信号通路来减轻HIRI。这些发现为其在HIRI预防和治疗中的临床应用提供了理论基础。
部分摘录
意义声明
肝脏缺血-再灌注损伤（HIRI）是在肝切除术、肝脏移植和出血性休克期间常见的临床挑战。这种情况可能导致严重的肝脏功能障碍和全身炎症反应综合征，可能发展为多器官衰竭甚至死亡。染料木黄酮是一种重要的异黄酮化合物，通过下调HMGB1的表达有效抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路介导的炎症反应。
试剂
染料木黄酮购自成都普飞德生物科技有限公司（中国成都；目录编号FX-10015），重组HMGB1（rHMGB1）购自Abcam（英国剑桥；目录编号ab255799）。
动物
雄性C57BL/6小鼠（6-8周龄，体重20-24克）由北京华福康生物科技有限公司提供，并在受控条件下饲养（温度：22±2°C，12小时光照/黑暗周期），自由进食和水。所有动物实验方案均获得动物伦理委员会的批准。
染料木黄酮缓解小鼠的HIRI
在之前的初步实验中，发现剂量为50、100和200 mg/kg的染料木黄酮可显著且剂量依赖性地降低HIRI小鼠的肝脏损伤标志物（ALT和AST）水平，并改善肝脏组织的病理损伤。其效果略低于阳性对照药物水飞蓟素（补充图S1）。因此，选择200 mg/kg的染料木黄酮进行后续正式实验。
讨论
HIRI常见于创伤性休克、肝脏移植和外科手术过程中。大量研究表明，肝脏移植和肝切除术的预后与HIRI密切相关（Dar等人，2019年；Huang等人，2021年），这一现象引起了全球的广泛关注，凸显了开发更有效治疗药物的迫切需求。我们的初步发现表明，染料木黄酮通过降低ALT和AST的活性来缓解HIRI。
结论
我们研究了染料木黄酮对HIRI的保护作用。染料木黄酮通过HMGB1诱导的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路减少了炎症反应和肝细胞凋亡（图8）。我们的发现为HIRI的临床治疗提供了新的方向。
伦理批准
动物实验方案获得了华中科技大学同济医学院动物护理和使用委员会的批准（编号TJH-201902003）。
资助
本研究由湖北省自然科学基金资助（XJ2023002101）。
CRediT作者贡献声明
李尚林：概念构思、数据管理、研究、方法学、初稿撰写。
胡新月：数据管理、研究、方法学。
严学强：数据管理、研究。
彭飞：数据管理、研究。
秦新科：正式分析。
刘欣：正式分析。
赵光远：概念构思、项目管理、监督、审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
