编辑推荐：
日本蝮蛇（Rhabdophis tigrinus）毒液中分离纯化并鉴定了一种新型锌依赖性蛇毒金属蛋白酶（SVMP）-类凝血酶原激活物Rhabdarin，其具有无需钙离子及共因子即可激活凝血酶原的独特特性，并表现出对合成荧光肽底物的严格序列依赖性，为SVMP家族分类与功能机制提供了新证据。
井上信博 | 樱井良彦 | 芸沼京子 | 由井克也 | 久保里沙耶 | 武田智弘 | 高田拓海 | 佐佐木大辅 | 松本雅纪典 | 藤村良宏 | 笠田翔吾
日本奈良县柏原市奈良医科大学法医学系
摘要
Rhabdophis tigrinus是日本常见的毒蛇，其产生的毒液具有强烈的促凝血活性，能够激活人体中的凝血酶原。然而，这种毒液中的凝血酶原激活因子的生化特性和分类尚未明确。在本研究中，我们从R. tigrinus的毒液中部分纯化了该激活因子（暂时命名为“Rhabdarin”），并对其酶学和结构特性进行了分析。该因子通过凝胶过滤和羟基磷灰石色谱法进行部分纯化，得到了一种二硫键连接的同源二聚体（非还原形式约110 kDa；还原形式约55 kDa）。Rhabdarin能够在不含钙、磷脂或因子V的情况下诱导人血浆凝固，这与其属于A型凝血酶原激活因子一致。SDS-PAGE分析显示，Rhabdarin能够按剂量和时间顺序将凝血酶原切割为meizothrombin desF1、α-thrombin以及片段1和2，切割位点位于Arg320。值得注意的是，与典型的丝氨酸蛋白酶不同，Rhabdarin无法切割小分子显色底物S-2222和S-2765，但能有效切割模拟天然切割位点的合成荧光肽。这种严格依赖于序列和上下文的特异性使其区别于传统的凝血酶。抑制剂实验表明，乙二胺-N,N,N′,N′-四乙酸、乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸以及锌螯合剂1,10-菲咯啉能够完全抑制其活性，而苯甲基磺酰氟则无此效果，从而证实Rhabdarin是一种依赖锌的金属蛋白酶。LC/MS分析进一步确认了该因子含有蛇毒金属蛋白酶的保守区域肽片段，包括ZnMc_adamalysin_II结构域。这些发现表明Rhabdarin是一种依赖锌的A型凝血酶原激活因子，具有广泛的底物识别能力，为这种独特促凝血酶的分类和机制提供了新的见解。
引言
Rhabdophis tigrinus（又称日本虎纹蛇）与Gloydius blomhoffii（日本蝰蛇）是日本最常见的毒蛇之一。R. tigrinus体内含有两种不同的毒素：一种是从日本蟾蜍()体内获取的外源性防御性分泌物，其中含有强心甾体 bufadienolides；另一种是储存在Duvernoy腺体中的内源性蛋白质毒液。1932年就有报道指出R. tigrinus的毒液具有导致出血性疾病的毒性（Sakamoto, 1932），但这一发现后来被忽视。自1971年以来，已确认五例致命的中毒病例（Hifumi et al., 2021）。早期研究认为该毒素主要通过增强纤维蛋白溶解来影响人体凝血系统（Mittleman and Goris, 1974），但Sakai等人证明其实际通过激活凝血酶原发挥促凝血作用（Sakai et al., 1983）。后续研究表明，该毒液具有强烈的促凝血活性，可引发微血栓形成，在严重情况下会导致脑出血、急性肾衰竭和弥散性血管内凝血（Ogawa et al., 1986）。尽管已知该毒液含有凝血酶原激活因子，但其具体结构特征及其在四大已知蛇毒凝血酶原激活因子分类（A–D）中的位置尚未明确。本研究旨在阐明该激活因子的生化及结构特性，并确定其分类，重点关注其肽级结构信息、钙依赖性、辅因子需求以及对特定抑制剂的敏感性。材料
我们从日本蛇类研究所（群马县）购买了R. tigrinus的冻干毒液。显色底物S-2222和S-2765购自美国马萨诸塞州贝德福德的Chromogenix公司。合成荧光底物RI20由20个氨基酸残基组成，其中包含10个位于凝血酶原切割位点附近的残基（Ac-ELLES-K(2-(N-甲基氨基)苯甲酰, Nma)-IDGR/IVEG-K(2,4-二硝基苯, Dnp)-DAEIG-NH2），由大阪的Peptide Institute公司合成。
凝血酶原激活因子的部分纯化
将R. tigrinus的粗毒液溶解在50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中，然后通过Sephacryl凝胶过滤柱进行分离，检测到四个主要蛋白质峰（图1）。其中第一个峰对应的组分具有促凝血活性，将这些组分合并后进一步纯化。随后将这些组分加入预先用20 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）平衡的羟基磷灰石柱中，使用线性磷酸盐梯度进行洗脱。
讨论
Rhabdophis tigrinus属于游蛇科（Colubridae）Natricinae亚科。虽然Viperidae和Elapidae科蛇类的凝血酶原激活因子已有大量研究，但Natricinae亚科的相关研究非常有限。在本研究中，我们从R. tigrinus的毒液中部分纯化了凝血酶原激活因子，并对其生化特性和结构进行了分析。R. tigrinus的凝血酶原激活活性早已被认识，但相关研究较为有限。
结论
总体而言，这些研究结果阐明了R. tigrinus凝血酶原激活因子的生化性质，并首次提供了将其与SVMP家族联系起来的序列证据。Rhabdarin的特异性、金属依赖性和高分子量特征表明它是一种具有广泛底物识别能力的独特促凝血因子，为未来的结构和功能研究奠定了基础。
伦理声明
本研究的所有操作均符合赫尔辛基宣言及相关国家和国际委员会关于人类实验的伦理标准。
资助
本研究得到了奈良医科大学青年科学家资助计划的支持（奈良医科大学公立大学法人）。
作者贡献声明
井上信博：概念设计、数据管理、数据分析、资金获取、实验设计、结果可视化、初稿撰写。樱井良彦：概念设计、监督、结果验证、修订与编辑。芸沼京子：数据分析、实验设计、结果撰写、修订与编辑。由井克也：数据分析、实验设计、结果撰写、修订与编辑。久保里沙耶：数据分析、实验设计、结果撰写、修订与编辑。武田智弘：实验方法设计、结果验证、修订与编辑。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本研究结果的财务利益冲突或个人关系。
致谢
不适用。
