《Nature Methods》：Isotonic and minimally invasive optical clearing media for live cell imaging ex vivo and in vivo
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本文介绍了一项发表于《Nature Methods》的研究，研究人员开发了一种名为SeeDB-Live的活体组织光学透明化新介质，旨在解决因组织不透明而限制活体组织，特别是哺乳动物脑组织的深层荧光成像的难题。该介质以牛血清白蛋白为主要成分，具有低渗透压和低侵入性的特点，能在保持神经元电生理特性和行为功能完整的同时，显著提升活体组织的成像深度，适用于类器官、急性脑片及活体小鼠大脑的结构与功能成像，包括钙成像和电压成像，从而极大地拓展了活体荧光成像的深度和模式。
在生物医学研究领域，我们常常需要通过荧光显微镜窥探活体组织内部动态的生命过程，比如大脑神经元如何通过电信号“交谈”，或是药物如何影响肿瘤细胞的生长。然而，光线在穿过生物组织时会像穿过浓雾一样发生散射，使得成像深度通常局限于几百微米，深层结构一片模糊。这成为了一个长期存在的挑战，尤其对于复杂且动态的大脑研究而言，无法深入观察健康的活体组织严重制约了我们对神经环路、疾病机制等关键问题的理解。
此前，科学家们发展出了多种“组织透明化”技术，通过化学处理使固定的（即已死亡的）组织变得透明，从而实现高分辨率的三维成像。然而，这些方法大多对活细胞有毒，无法用于观察生命活动。虽然有一些毒性较低的化学物质（如甘油、二甲基亚砜）被尝试用于皮肤等组织，但它们会干扰细胞功能。近期也有研究试图通过高渗（渗透压远高于生理水平）的染料来实现活体皮肤透明化，但这破坏了正常的生理环境。因此，如何在维持细胞完整功能的前提下，让活的哺乳动物细胞和组织变得透明，一直悬而未决。
现在，一项发表在顶尖期刊《Nature Methods》上的研究带来了突破。由Takeshi Imai（今井健）领导的研究团队成功开发出一种名为SeeDB-Live的新型组织透明化介质。它的核心是一种我们非常熟悉的成分——牛血清白蛋白。研究团队发现，将BSA以特定浓度（15-17% wt/vol）溶解在生理盐水或细胞培养液中，可以将其折射率精确调整到1.363-1.366。这个数值恰好与活体哺乳动物细胞质的折射率完美匹配。当细胞外介质的折射率与细胞质相匹配时，光线散射被大幅降低，组织从而变得透明。更重要的是，BSA本身是一种分子量大、呈球状的聚合物，它在水溶液中产生的渗透压极低，这意味着可以制备出与生理环境等渗的透明化溶液，对细胞的影响微乎其微。
为了验证SeeDB-Live的效果和安全性，研究人员运用了多项关键技术。他们使用了表达各种荧光蛋白或钙离子指示剂（如GCaMP6f/s、jGCaMP8m）的转基因小鼠（如Thy1-YFP-H, Thy1-GCaMP6f）或通过病毒载体（AAV）在特定细胞中表达指示剂。研究涉及多种样本：培养的细胞球体、肠道和大脑类器官、小鼠急性脑切片以及在体（麻醉或清醒）的小鼠大脑。成像技术涵盖了共聚焦显微镜、双光子显微镜以及用于超高速电压成像的宽场显微镜。功能验证则通过膜片钳记录神经元电生理特性、钙成像记录神经元活动、以及小鼠行为学测试（如跑步机运动、悬挂实验）来评估SeeDB-Live的侵入性。
研究策略：寻找对活细胞低侵入的透明化剂
研究团队首先明确了策略：要实现活细胞在等渗条件下的透明化，必须使用低渗透压的高分子量化学物质。他们筛选了多种物质，发现膜渗透性化学物（如甘油）在达到所需折射率时会完全破坏细胞功能（如钙响应）。而一些膜非渗透性的球形聚合物（如碘克沙醇、Ficoll70）能保持细胞功能，但它们的渗透压、粘度或比重可能不理想。最终，他们发现低盐牛血清白蛋白在达到目标折射率时，具有异常低的渗透压，且对多种细胞（如HeLa细胞、心肌细胞、海马神经元）的生长和功能影响最小。
SeeDB-Live在活体球状体和类器官成像中的应用
在HeLa细胞球状体和肠道类器官中，SeeDB-Live能在数小时内使其变得透明，且不影响其长期生长。共聚焦成像显示，处理后的成像深度和信号亮度，尤其是在深层区域，得到了显著提升。在表达钙指示剂的肠道类器官和大脑类器官中，SeeDB-Live使得记录细胞对刺激（如高钾）的钙响应成为可能，证明了其在类器官功能研究中的实用性。
透明化急性脑切片并提升成像深度
将急性小鼠脑切片置于SeeDB-Live/ACSF中灌流，可在30分钟内使其变透明。在Thy1-YFP-H小鼠的脑切片中，无论是共聚焦还是双光子显微镜，SeeDB-Live都将皮层神经元的成像深度提高了约2倍。此外，利用细胞外染料进行“阴影成像”的技术，在SeeDB-Live的帮助下，能够对急性脑切片更深层的完整细胞结构进行高分辨率成像，这对于神经连接组学研究具有重要意义。
神经元电生理特性在SeeDB-Live中基本得以保持
通过膜片钳技术记录急性脑切片中皮层第五层椎体神经元（L5ET）的电生理特性，研究人员发现，在校准了液接电位后，SeeDB-Live处理对神经元的静息膜电位、动作电位发放频率等关键特性没有显著影响。虽然部分参数（如动作电位阈值、输入电阻）有轻微变化，但整体生理功能得以维持。
利用SeeDB-Live进行脑切片钙成像
在表达GCaMP6f的小鼠嗅球切片中，使用双光子显微镜成像，发现SeeDB-Live处理前后，僧帽/簇状细胞的基线活动频率以及对NMDA（N-甲基-D-天冬氨酸）和甘氨酸的诱发反应幅度均无显著差异。特别值得注意的是，在SeeDB-Live处理下，使用常规的共聚焦显微镜就能在100微米深度清晰地记录到僧帽细胞的自发钙活动，而这在普通ACSF中是无法实现的，这大大降低了对昂贵双光子显微镜的依赖。
活体小鼠大脑皮层的透明化与功能成像
对活体麻醉小鼠进行颅骨开窗和硬脑膜切开后，将SeeDB-Live溶液灌注于大脑皮层表面。荧光标记的BSA可渗透至皮层约500微米深度。在Thy1-YFP-H小鼠中，双光子成像显示，SeeDB-Live处理1小时后，位于皮层深部（600-800微米）的L5ET神经元胞体的荧光亮度增强了约3倍，树突棘等细微结构也变得更加清晰。行为学测试表明，无论是急性还是慢性处理，SeeDB-Live对小鼠的运动能力、协调性和进食行为均未产生可检测的毒性或影响。
活体功能成像：保留感觉反应
在活体麻醉小鼠的初级视觉皮层（V1），研究人员比较了SeeDB-Live处理前后，第四层神经元对视觉光栅刺激的反应。发现神经元的偏好朝向、反应幅度、朝向选择性和调谐宽度等关键特性均得到了很好的保留。在嗅球，SeeDB-Live改善了对深部僧帽细胞气味反应（包括抑制性反应）的成像质量。此外，结合快速电压指示剂JEDI-2P，研究团队首次在活体皮层深部（~560微米）可靠地记录到了单个神经元的动作电位。
宽场电压成像的应用拓展
SeeDB-Live带来的透明度提升，使得传统上因光散射严重而难以用于深层成像的宽场（或共聚焦）显微镜得以大显身手。在急性脑切片中，结合超高速CMOS相机和化学遗传电压指示剂Voltron2，研究人员首次在单次拍摄（无需平均）的条件下，清晰记录了僧帽细胞动作电位在树突上的反向传播过程，并测量了其传导延迟。在活体小鼠嗅球中，利用SeeDB-Live和高数值孔径、短焦深的物镜，实现了对约90微米深度、上百个树突区域电压活动的同时记录，并成功解析了属于同一嗅小球或不同嗅小球的神经元集群的同步活动模式，为研究神经网络的群体电压动态提供了强大工具。
结论与展望
总而言之，这项研究开发的SeeDB-Live首次实现了在维持哺乳动物活细胞正常生理功能和渗透压的前提下，对组织进行有效的光学透明化。它显著提升了包括类器官、急性脑片和活体大脑在内的多种样本的荧光成像深度和信噪比，且对神经元电生理、动物行为及组织健康的影响微乎其微。SeeDB-Live的核心优势在于其“等渗”和“低侵入性”，这使得它特别适用于神经科学等领域对生理状态要求严苛的功能性研究。
其重要意义在于极大地拓展了活体荧光成像的技术边界：首先，它使得常规共聚焦显微镜能够用于深部组织的功能成像，降低了对双光子显微镜的依赖；其次，它为高速、大规模的电压成像打开了新局面，使得在组织甚至活体水平研究亚细胞和群体水平的电压动态成为可能；最后，它有望与更先进的光学技术（如大视野双光子显微镜、超分辨成像、光刺激技术等）结合，推动我们对组织与器官尺度生命动态的理解。尽管BSA对大块组织的渗透性仍是未来应用的挑战，但通过改进递送方式（如脑脊液循环输注）或结合可移除颅窗进行慢性研究，SeeDB-Live无疑将成为探索活体生物复杂动态世界的利器。
