《Nature Microbiology》：Epitope-focused discovery of SARS-CoV-2 antibodies that potently neutralize Omicron variants
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本研究针对SARS-CoV-2奥密克戎（Omicron）变异株的快速进化导致众多已获批单克隆抗体（mAb）失效的难题，开展了一项表位聚焦的单克隆抗体发现研究。科研人员利用糖基化掩蔽（glycan-masked）的受体结合域（RBD）抗原，富集并分离出了靶向RBD上第3类位点、能强效中和多种奥密克戎亚变体（如XBB、BQ.1.1）的单克隆抗体。该研究不仅验证了糖基掩蔽策略用于靶向抗体发现的效用，也为应对快速变异的病毒提供了新的抗体发现方法和有潜力的治疗候选物。
新冠病毒（SARS-CoV-2）的肆虐催生了对抗体疗法的巨大需求，尤其是那些能靶向病毒表面刺突（S）蛋白、阻止其进入细胞的中和抗体。然而，病毒的快速进化，特别是奥密克戎（Omicron）系列变异株的出现，带来了严峻挑战。这些变异株在病毒的关键区域——受体结合域（RBD）上积累了众多突变，使得许多曾经有效的临床获批抗体纷纷“失效”，亟需新的策略来发现能够应对不断变异病毒的“广谱”武器。
为了应对这一挑战，并快速发现具有理想特异性和功能特性的新抗体，研究人员在《Nature Microbiology》上发表了一项创新性研究。他们采用了一种称为“表位聚焦”的抗体发现新方法。其核心思路是：既然病毒在RBD的特定区域（即“抗原位点”）不断突变以逃逸现有抗体，那么是否可以主动“屏蔽”掉这些易变区域，从而富集并找到那些能结合在相对保守、且能有效中和病毒位点上的稀有抗体呢？为此，他们设计并使用了“糖基化掩蔽”抗原。具体而言，他们在奥密克戎BA.1变异株RBD的一个关键位置（第444位点）引入了N-连接糖基化修饰。这个位置位于RBD上被称为“第3类”的抗原位点，是许多重要中和抗体的靶点。这个添加的庞大糖链就像一把“糖伞”，物理性地遮挡了该区域，使得大多数结合此位点的抗体无法识别。
带着这个精心设计的“诱饵”，研究人员从一名感染过BA.1变异株的康复者体内分离出记忆B细胞。他们利用流式细胞术，巧妙地筛选那些能结合天然XBB或BQ.1.1变异株RBD，但却无法结合被“糖伞”保护的BA.1 RBD的B细胞。理论上，这类B细胞所编码的抗体，正是能避开糖链遮挡、结合到第3类位点保守区域的“高手”。通过这一策略，他们成功分离并表达了303个单克隆抗体。
研究发现，其中许多抗体表现出了令人振奋的广谱中和能力。它们不仅能强效中和早期的WA1/2020毒株，对当前流行且免疫逃逸能力极强的XBB.1.5、BQ.1.1等奥密克戎亚变体也显示出极高的中和活性。进一步的实验证实，这些抗体确实主要靶向RBD的第3类位点。研究人员还挑选了部分抗体，在表达人ACE2受体的转基因小鼠模型中进行了测试。结果显示，提前给予这些抗体能显著降低小鼠感染XBB.1.5病毒后的肺部病毒载量，证明了其在体内的保护效力。为了深入理解这些抗体为何如此有效，研究人员还利用冷冻电镜（cryo-EM）和X射线晶体学解析了代表性抗体与病毒S蛋白或RBD的复合物结构。结构分析清晰地展示了抗体如何精确地结合在第3类位点上，并揭示了某些抗体能够耐受该位点关键突变（如K444T、R346T）的结构基础，从原子层面解释了其广谱中和能力的机制。
本研究主要采用了以下几项关键技术方法：1）利用流式细胞术和糖基化掩蔽抗原探针，从康复者（参与者D2102等）的外周血单核细胞（PBMC）中富集并分选靶向特定表位的记忆B细胞；2）采用基于Beacon光流控系统的单细胞功能筛选，快速鉴定分泌具有受体（hACE2）阻断活性抗体的B细胞；3）结合10x Genomics单细胞测序和Sanger测序，高通量获取抗体重链和轻链可变区基因序列；4）建立高通量微型化和中型化重组抗体表达与纯化平台，用于快速表征大量抗体；5）运用假病毒和真病毒中和试验、竞争结合ELISA、表位作图等全面评估抗体的结合广度、中和效力及作用机制；6）通过冷冻电镜和X射线晶体学解析抗体-抗原复合物结构，阐明其分子识别机制。
结果部分归纳如下：
Epitope-focused mAb discovery approach to identify class-3-specific B cells
研究人员成功设计并表达了在K444位点糖基化的BA.1 RBD（BA.1_444glyc），证实其能有效屏蔽已知的第3类抗体（如LY-CoV1404）的结合。利用该抗原与XBB或BQ.1.1 RBD形成的四聚体进行双色流式分选，他们从参与者D2102体内富集到了XBB-RBD+、444glyc-RBD?或BQ.1.1-RBD+、444glyc-RBD?的B细胞群体。这些细胞在体外扩增后分泌的抗体能有效竞争LY-CoV1404的结合，证实了该策略成功富集到了靶向第3类位点的B细胞。
Generation and initial characterization of class-3-specific RBD-targeting mAbs
对分选细胞进行单细胞功能筛选和测序后，研究人员高通量表达了303个单克隆抗体。初步结合与中和实验显示，大量抗体能结合SARS-CoV-2野生型RBD，其中许多能强效中和XBB.1.5和/或BQ.1.1假病毒。竞争结合实验表明，相当比例的抗体与第3类位点参照抗体LY-CoV1404或S309竞争，验证了表位富集的有效性。
Comprehensive characterization of the binding and neutralization profiles of downselected class-3-specific mAbs
从初始面板中精选出50个抗体进行深入表征。根据结合谱（对XBB、BQ.1.1、SARS-CoV等的反应性）将其分为不同组别。定量中和实验表明，不同抗体对不同变异株（如XBB.1.5、BQ.1.1、BN.1、KP.3）的中和效力存在差异，反映了其表位细微差别。大部分测试抗体能完全或部分阻断hACE2受体与S蛋白的结合。
Class-3-site-specific mAbs potently neutralize authentic SARS-CoV-2
挑选的16个代表性抗体在真病毒中和试验中证实了其活性，能有效中和D614G、XBB.1.5、EG.5.1和BQ.1.1等 authentic SARS-CoV-2病毒，结果与假病毒数据基本一致。
Class-3-site-specific mAbs reduce viral titre in mice
在K18-hACE2转基因小鼠模型中，被动输注COV2-3872、-3892、-3967、-4094等抗体，能显著降低小鼠感染XBB.1.5病毒后的肺部病毒滴度，证明其在体内具有保护作用。
Structural studies confirm the enrichment of a diverse panel of class-3-site-specific mAbs
通过负染电镜、冷冻电镜和X射线晶体学解析了多个抗体（如COV2-3835、COV2-3891、COV2-3906）与S蛋白或RBD的复合物结构。结构证实COV2-3835和COV2-3891结合于第3类位点，而COV2-3906结合于第4类位点。结构分析揭示了COV2-3891通过大量主链相互作用以及与保守残基（如K440、R498）的作用，从而实现对XBB和BQ.1.1等不同变异株广泛交叉反应的分子基础；同时也解释了COV2-3835为何因BQ.1.1的R346T和K444T突变而丧失对其的中和能力。
B cell and mAb profiling from additional research participants
将相同的流式分选策略应用于另外4名参与者，结果在多人中均能检测到XBB-RBD+、444glyc-RBD?的B细胞群体，并从其中两名参与者中成功分离出能与LY-CoV1404竞争的第3类位点特异性抗体，证明了该富集策略在不同个体中的普适性。
结论与讨论：本研究成功地开发并验证了一种基于糖基化掩蔽抗原的表位聚焦抗体发现新策略。该策略能够高效地从康复者体内富集并分离出靶向SARS-CoV-2 RBD上保守的第3类抗原位点、并能强效中和多种奥密克戎变异株的单克隆抗体。这些抗体在体外和体内动物模型中均显示出良好的抗病毒活性。结构生物学研究从原子层面阐明了部分抗体具有广谱中和能力的结构基础，并确认了该策略能够获得靶向同一抗原位点但结合角度和精确表位各异的多样化抗体。研究结果表明，尽管目标B细胞在人体内频率较低，但通过合理的抗原工程设计进行定向富集，是快速发现应对快速变异病毒的有用抗体的有效途径。此外，该策略不仅限于SARS-CoV-2，也为未来针对其他快速进化病原体的抗体发现和疫苗设计提供了新的思路和工具。通过聚焦于保守且功能重要的表位，这种方法有望加速下一代广谱抗病毒疗法和疫苗的研发进程。
