sGC-cGMP-PKG信号通路通过磷酸化ULK1(Ser556)激活自噬抑制主动脉瓣钙化

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G signaling attenuates aortic valve calcification through ULK1-mediated autophagy

钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）目前缺乏有效药物干预手段。本研究聚焦cGMP-PKG信号通路，通过多组学分析、基因编辑小鼠模型及临床样本验证，发现可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）激动剂维利西呱（Vericiguat）可通过激活PKGI，磷酸化自噬启动关键蛋白ULK1（Ser556），增强自噬流，从而抑制瓣膜间质细胞（VICs）的成骨分化，减轻瓣膜钙化。该研究为CAVD的药物治疗提供了新靶点与潜在临床转化策略。

　　

心脏是人体的发动机，而主动脉瓣则是心脏血液泵出的关键“阀门”。随着年龄增长，一种名为钙化性主动脉瓣疾病（Calcific Aortic Valve Disease, CAVD）的疾病悄然高发，它会导致瓣膜增厚、变硬、钙化，最终形成主动脉瓣狭窄（Aortic Stenosis, AS）。患者会感到胸痛、晕厥、呼吸困难，严重时心力衰竭甚至猝死的风险极高。据统计，在75岁以上的老年人群中，CAVD的患病率高达约10%。目前，尚无任何药物被证实能有效延缓或逆转CAVD的进程。一旦病情发展到重度狭窄，唯一的有效治疗方法是进行创伤性的主动脉瓣置换手术，这对许多高龄、体弱的患者而言风险巨大。因此，科学家们一直在苦苦探寻导致瓣膜钙化的根本原因，以期找到能够“软化”瓣膜的药物靶点。

近期，一篇发表在《信号转导与靶向治疗》（Signal Transduction and Targeted Therapy）杂志上的研究，为破解这一难题带来了新的曙光。这项研究将目光投向了一个在心血管系统中扮演重要“信使”角色的通路——环磷酸鸟苷-蛋白激酶G（cGMP-PKG）信号通路。研究人员发现，这条通路在钙化的主动脉瓣中“失活”了。那么，重新激活它，能否成为阻止瓣膜钙化的新钥匙？研究团队开展了一系列从临床到实验室，从分子到动物模型的深入探索，最终揭示了一个全新的保护机制：sGC激动剂药物维利西呱（Vericiguat）能够通过激活cGMP-PKG信号，促使下游的蛋白激酶G I型（PKGI）磷酸化自噬过程的核心启动因子ULK1蛋白的第556位丝氨酸（Ser⁵⁵⁶），从而“唤醒”细胞的自噬清理功能，清除有害物质，维持细胞健康，最终有效抑制瓣膜间质细胞向成骨样细胞转化，减轻瓣膜钙化。这一发现不仅阐明了CAVD发生发展的新机制，也为将已上市的心力衰竭治疗药物维利西呱“老药新用”，拓展至CAVD治疗领域，提供了坚实的理论依据和令人鼓舞的临床前证据。

为了回答上述科学问题，研究人员综合运用了多种关键技术方法。首先，他们利用临床样本队列（来自四川大学华西医院的非钙化与钙化主动脉瓣患者组织及血清样本）进行了转录组测序（RNA-seq）、蛋白质印迹（Western Blot）和免疫荧光染色，系统评估了CAVD进程中cGMP-PKG通路的变化。其次，通过构建基因工程小鼠模型（包括蛋白激酶G I型杂合子敲除（Prkg1^+/?）小鼠、低密度脂蛋白受体敲除（Ldlr^?/?）高脂饮食模型以及主动脉瓣导丝损伤模型）并进行药物（维利西呱）干预，在体验证了该通路的保护作用。再者，分离培养原代人主动脉瓣间质细胞（hVICs），建立体外成骨诱导模型，结合小干扰RNA（siRNA）基因沉默、药理激活/抑制等手段，在细胞水平阐明机制。最后，研究通过串联质谱标签（TMT）定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析、免疫共沉淀（Co-IP）、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）以及腺相关病毒（AAV）介导的体内基因过表达等技术，精准锁定了PKGI的直接作用底物ULK1及其关键磷酸化位点Ser⁵⁵⁶。

研究结果

cGMP?PKG通路在CAVD进展中被抑制

通过对人类钙化与非钙化主动脉瓣组织的RNA测序数据分析，研究人员发现cGMP-PKG信号通路相关基因在钙化瓣膜中显著下调。临床样本的蛋白质印迹和免疫荧光染色进一步证实，在CAVD患者瓣膜组织中，成骨标志物碱性磷酸酶（ALP）和Runt相关转录因子2（RUNX2）表达升高，而PKGI蛋白水平降低。此外，患者血清中的cGMP浓度与瓣膜钙化严重程度及跨瓣压差呈负相关。在体外，用成骨培养基（OM）诱导hVICs成骨分化时，也观察到了PKGI表达和cGMP水平的下调。这些结果一致表明，cGMP-PKG信号通路的抑制是CAVD进展的一个特征。

PKGI单倍体不足加剧主动脉瓣钙化

为了在体验证PKGI的功能，研究构建了Prkg1^+/?小鼠，并联合主动脉瓣导丝损伤（AVWI）建立CAVD模型。结果显示，与野生型小鼠相比，Prkg1^+/?小鼠在损伤后表现出更严重的瓣膜增厚、钙化（Alizarin Red染色阳性面积增加）以及更高的跨瓣峰值流速。RUNX2的免疫荧光染色也显示其表达增强。在体外，利用siRNA敲低hVICs中的PKGI表达，同样加剧了细胞的钙沉积和成骨标志物表达。这些发现证明PKGI缺失会加速主动脉瓣钙化，提示cGMP-PKG信号具有保护作用。

激活cGMP-PKG信号通路在体外和离体减轻钙化

接下来，研究在OM诱导的hVICs中，使用了三种药物来激活cGMP-PKG通路：可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）激动剂维利西呱（VER）、脑钠肽（BNP，颗粒性鸟苷酸环化酶pGC激活剂）和磷酸二酯酶5抑制剂西地那非。结果发现，三种药物均能显著减少钙沉积和ALP活性，其中维利西呱效果最强。成骨标志物RUNX2的蛋白水平也相应降低。在离体培养的人主动脉瓣瓣叶中，维利西呱处理也能有效减轻OM诱导的钙化。重要的是，当使用PKGI肽抑制剂（PKGi）阻断PKGI活性时，维利西呱的保护作用被取消，证实了PKGI是药物发挥抗钙化作用的下游关键效应分子。

使用sGC激动剂维利西呱在体内激活cGMP-PKG信号通路可改善主动脉瓣钙化

鉴于维利西呱在体外的优异效果，研究进一步在两种广泛使用的小鼠CAVD模型（Ldlr^?/?小鼠高胆固醇饮食模型和AVWI模型）中评估其治疗效果。在这两种模型中，维利西呱治疗均能显著降低跨瓣峰值流速，减少瓣膜厚度和钙化面积，并抑制瓣膜组织中RUNX2的表达。然而，在Prkg1^+/?小鼠中，维利西呱改善血流动力学和抑制钙化的效果被削弱，这再次强调了PKGI是维利西呱发挥疗效所必需的。

cGMP-PKG信号通过增强自噬流来减轻hVIC的成骨分化

为了深入探索机制，研究人员对经维利西呱处理和未处理的hVICs进行了转录组和蛋白质组学分析。基因本体（GO）富集分析和基因集富集分析（GSEA）均提示，线粒体去极化和活性氧（ROS）代谢过程是维利西呱调节的关键通路。功能实验证实，OM诱导导致细胞内ROS水平升高、线粒体膜电位（ΔΨm）下降、氧消耗率（OCR）和ATP产量降低，而维利西呱处理能有效逆转这些异常。蛋白质组学KEGG分析进一步显示，自噬通路显著富集。通过透射电镜（TEM）观察和蛋白质印迹检测发现，与正常瓣膜相比，CAVD患者瓣膜组织中自噬小体形成减少，自噬标志物微管相关蛋白1轻链3（LC3）-II/LC3-I比率下降，自噬底物p62积累。单细胞RNA测序（scRNA-seq）也发现，CAVD样本中的瓣膜间质细胞亚群其自噬相关信号通路下调。这些证据共同表明，自噬流受损参与CAVD进展。当使用自噬流抑制剂巴弗洛霉素（Bafilomycin）时，PKGI激活剂8-溴-cGMP（8-Br-cGMP）对hVICs成骨分化的抑制作用被抵消，证明cGMP-PKG通路的保护作用依赖于功能完整的自噬。

ULK1的Ser⁵⁵⁶磷酸化促进PKGI介导的自噬和抗钙化作用

为了找到PKGI直接作用的靶点，研究进行了TMT定量磷酸化蛋白质组学分析。生物信息学富集分析（ClueGO和KEGG）显示，差异磷酸化蛋白显著富集于自噬相关通路。通过免疫共沉淀联合质谱分析，研究人员将自噬启动的关键激酶Unc-51样自噬激活激酶1（ULK1）鉴定为PKGI的潜在相互作用蛋白。蛋白对接模拟和体外激酶实验证实PKGI可以直接结合并磷酸化ULK1。磷酸化组学数据进一步锁定ULK1上的三个丝氨酸位点（Ser⁴⁷⁷, Ser⁴⁷⁹, Ser⁵⁵⁶）可能受PKGI调控。随后的功能拯救实验表明，将ULK1的Ser⁵⁵⁶突变为不能磷酸化的丙氨酸（S556A），会完全废除PKGI激活剂对hVICs成骨分化的抑制作用，而Ser⁴⁷⁷或Ser⁴⁷⁹的突变则无此影响。在体实验中，通过腺相关病毒2型（AAV2）载体携带Periostin启动子，特异性地在瓣膜间质细胞中过表达ULK1-S556A突变体，也消除了维利西呱在AVWI模型中的抗钙化益处。这最终证明，PKGI通过磷酸化ULK1的Ser⁵⁵⁶位点来激活自噬，是其抑制主动脉瓣钙化的核心分子机制。

研究结论与意义

本研究系统性地揭示了sGC-cGMP-PKG信号通路在CAVD中的保护作用及全新机制。研究证实，该通路在CAVD进程中受到抑制，而通过药理学手段（如sGC激动剂维利西呱）重新激活这一通路，能够有效缓解临床前模型中的主动脉瓣钙化。在机制上，PKGI作为cGMP的关键下游效应器，通过直接磷酸化自噬启动子ULK1的Ser⁵⁵⁶位点，增强细胞自噬流，从而改善线粒体功能、减轻氧化应激，最终抑制瓣膜间质细胞的成骨样分化。

这项研究的意义重大。首先，它从全新的角度阐明了CAVD的发病机制，将cGMP-PKG信号、自噬调控和瓣膜钙化紧密联系起来。其次，研究明确了ULK1 Ser⁵⁵⁶是PKGI发挥抗钙化作用的一个关键分子开关，为针对该通路的精准药物设计提供了潜在靶点。最为重要的是，研究验证了已获批用于治疗心力衰竭的sGC激动剂维利西呱在CAVD模型中的治疗潜力，为推进该药物的“老药新用”临床转化提供了强有力的临床前证据，有望为目前缺乏有效药物治疗的CAVD患者带来新的希望。尽管研究存在一些局限，如主要使用了雄性动物模型，未来需要在雌性模型中进行验证，但整体上，该工作深化了对CAVD病理机制的理解，并开辟了一条颇具前景的治疗新途径。