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本研究揭示了从污染土壤中分离的根际芽孢杆菌与假单胞菌株对铜(Cu)、铬(Cr)、镉(Cd)高达500 μg/mL的耐受性，并系统阐明了与其耐受性相关的多种机制，包括耐盐性、抗生素抗性、胞外聚合物(EPS)及生物表面活性剂合成。研究还证实了这些菌株对植物病原真菌Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli (Fop)和Stemphylium botryosum (St-bt)具有显著的抗真菌活性。该工作为利用多功能微生物进行重金属污染土壤的生物修复及植物病害的生物防治提供了有潜力的候选菌株和理论依据。
1. 引言
人类活动深刻改变了生态系统的生物与非生物组分。环境污染，特别是将有毒物质释放到空气、水和土壤中，对所有生物体及生态系统功能构成重大威胁。在各类污染中，重金属污染因其不可生物降解、易于在食物链中积累以及对人类和其他生物体产生广泛的负面影响，成为最紧迫的环境污染物之一。传统物理化学修复方法虽有效，但常成本高昂且可能产生二次废物。在此背景下，生物修复作为一种利用特定微生物和植物的代谢能力来固定、转化或去除重金属的有前途的替代方案应运而生。
植物有益微生物(PBM)，特别是植物根际促生细菌(PGPB)，在植物-土壤界面发挥着关键作用。在严重金属污染条件下，许多细菌类群进化出多种抗性机制，使其能够代谢、隔离重金属或将重金属转化为毒性较低的形态。芽孢杆菌(Bacillus)和假单胞菌(Pseudomonas)属因其显著的植物促生(PGP)特性，成为研究最广泛和应用最多的生物防治剂之一。本研究旨在评估选定的芽孢杆菌和假单胞菌菌株对铜(Cu)、铬(Cr)、镉(Cd)三种重金属的抗性能力，同时考察与之相关的功能性状，包括耐盐性、抗生素抗性、胞外多糖(EPS)合成、生物表面活性剂产生及抗真菌活性。
2. 材料与方法
2.1. 菌株来源
本研究使用了四株细菌菌株，最初于2010年从阿尔及利亚西部Sidi Belabbes和Mascara省采集的土壤样品中分离得到。这些菌株在2010年至2015年间进行了初步分离和系统发育表征，并于-20°C保存在含有25% (v/v)甘油的胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中。所有后续生理实验均在2024年进行。
2.2. 重金属耐受性评估
采用浊度法评估重金属耐受性。用铜(II)硫酸盐(CuSO4)、重铬酸钾(K2Cr2O7)或硫酸镉(CdSO4)的过滤除菌溶液补充LB肉汤，最终测试浓度为50、100、200、400和500 μg/mL。在625 nm处测量光密度(OD625)以量化细菌生长。
2.3. 与金属耐受性相关的潜在机制表征
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耐盐性: 在补充了0、200、400或600 mM NaCl的LB肉汤中评估菌株生长。
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抗生素抗性分析: 采用纸片扩散法在Mueller-Hinton (MH)琼脂上测定抗生素敏感性。使用抗生素包括阿米卡星(AK)、亚胺培南(IMP)、氨苄西林(AM)、庆大霉素(GEN)和夫西地酸钠(FC)。
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胞外多糖(EPS)生产: 通过将菌株划线到补充了10%蔗糖的MSE琼脂培养基上来进行定性评估。EPS生产通过粘稠、粘液状菌落的出现来推断。
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生物表面活性剂生产测定: 评估培养物上清液降低表面张力的能力，计算表面张力降低百分比(STR)。
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抗真菌活性测定: 使用双重培养技术评估抗真菌活性。将7天龄真菌培养物的琼脂块置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平皿中心，四周等距离放置24小时细菌培养物的琼脂块。通过计算抑制百分比(PI)来量化真菌生长抑制。
3. 结果
3.1. 系统发育鉴定
16S rRNA基因序列构建的系统发育树明确了四株细菌的系统发育关系，分属于芽孢杆菌属（三株）和假单胞菌属（一株）。其中，Laica 1鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，Laica 2和Laica 3鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，Laica 4鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
3.2. 重金属耐受性
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硫酸铜耐受性: 当Cu浓度超过100 μg/mL时，细菌生长的抑制作用变得更加明显。在测试浓度范围（50-500 μg/mL）内，菌株Laica 4表现出最高的铜抗性水平，其次是Laica 2和Laica 3。菌株Laica 1是四个测试菌株中对铜抗性最弱的。
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重铬酸钾耐受性: 在浓度介于50至400 μg/mL之间时，菌株表现出高耐受性。暴露于500 μg/mL重铬酸钾导致OD值显著下降。在铬浓度为50至400 μg/mL时，四个菌株表现出相似的抗性水平。菌株Laica 1抗性最强，其次是Laica 3和Laica 4，而Laica 2对铬的抗性最弱。
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硫酸镉耐受性: 所有菌株在50 μg/mL时表现出稳健的抗性。值得注意的是，菌株Laica 4表现出最高的抗性。随着硫酸镉浓度增加到100 μg/mL以上，观察到光密度逐渐下降。在镉浓度为50 μg/mL时，菌株Laica 4抗性最强，其次是Laica 3和Laica 1。在50至400 μg/mL之间，四个菌株显示出非常相似的生长曲线，表明抗性水平相当。在500 μg/mL时，Laica 2抗性最强，Laica 4对镉的抗性最弱。
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重金属抗性总结: 在最高浓度500 μg/mL时，菌株Laica 1 (Bacillus amyloliquefaciens) 对铜和铬表现出最高的总体抗性，OD值分别为1.144 ± 0.003（铜）和0.679 ± 0.009（铬）。对于镉，Laica 4在50 μg/mL时的OD值显著高于其他菌株，在500 μg/mL时所有菌株的OD值收敛到相似水平，表明Laica 4 (Pseudomonas putida) 可被认为是最耐镉的菌株。
3.3. 与重金属耐受性相关的机制
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耐盐性: 在200和400 mM NaCl时，所有菌株显示出高到中等耐受性。在600 mM NaCl时，所有菌株的OD值均显著降低。其中，Laica 2是耐盐性最强的菌株，其次是Laica 1。
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抗生素抗性: 芽孢杆菌和假单胞菌菌株的抗生素抗性模式存在显著差异。这些菌株对多种抗生素表现出多重耐药性，包括亚胺培南、氨苄西林和夫西地酸钠。
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胞外多糖(EPS)合成: 评估显示，Laica 2和Laica 4是有效的EPS生产者，表现为粘稠、粘性菌落，这是EPS活跃合成的典型特征。相比之下，Laica 1和Laica 3在测试条件下未显示任何可见的EPS产生。
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生物表面活性剂生产: 所有芽孢杆菌和假单胞菌菌株均证实可产生生物表面活性剂，表面张力降低幅度在不同菌株间差异很大，从10.51 ± 3.87% 到 82.89 ± 5.01%。最高的降低记录于菌株Laica 2 (82.89 ± 5.01%)，其次是Laica 1 (70.36 ± 5.54%)。
3.4. 抗真菌活性
芽孢杆菌和假单胞菌菌株的抗真菌活性显示出对真菌分离株St-bt和Fop的菌丝生长抑制百分比存在明显差异。针对St-bt，菌株Laica 4显示出最强的效果，抑制率为83.34 ± 2.22%，其次是Laica 1，抑制率为56.41 ± 2.22%。针对Fop，Laica 1达到72.22 ± 1.92%的抑制率，而Laica 2产生较低但仍显著的53.33 ± 3.34%的抑制率。这些发现表明，特别是Laica 4和Laica 1等菌株具有显著的抗真菌特性，可用于农业和植物健康管理的生物防治。
4. 讨论
本研究中芽孢杆菌和假单胞菌菌株耐受高达500 μg/mL的铜(Cu)、铬(Cr)和镉(Cd)，这与它们来源于金属污染土壤相一致。细菌对重金属的抗性可能源于改变金属形态的氧化还原转化，以及实现细胞内隔离的依赖于代谢的摄取机制。对抗生素敏感性测试显示，这些芽孢杆菌和假单胞菌菌株对包括亚胺培南、氨苄西林和夫西地酸钠在内的几种抗生素具有多重耐药性。胞外多糖(EPS)生产在菌株Laica 2 (Bacillus subtilis) 和 Laica 4 (Pseudomonas putida) 中检测到。EPS是一种位于许多细菌细胞表面的天然胞外物质，其结构可以促进金属离子的螯合并限制其进入细胞包膜。生物表面活性剂是微生物代谢产物，可增强环境污染物的溶解度、生物利用度和生物降解。本研究评估的EPS和生物表面活性剂生产仍然是初步的，对其在金属螯合和解毒中作用的任何机制解释都应谨慎看待，并需要通过更详细的研究加以证实。尽管如此，该研究中鉴定出的菌株，特别是解淀粉芽孢杆菌Laica 1（高Cu/Cr抗性）和恶臭假单胞菌Laica 4（高Cd抗性和强抗真菌活性），代表了有前景的候选菌株，值得进一步研究和潜在的田间应用。所观察到的生物表面活性剂生产与抗真菌活性之间的关联性尤其值得注意。生物表面活性剂产量较高的菌株（如Laica 2）也表现出更强的抗真菌活性，而产量最低的菌株（Laica 3）的抗真菌效果也最弱。这种模式表明生物表面活性剂可能通过破坏膜机制直接导致真菌生长抑制。尽管存在讨论的局限性，本研究为了解所分离芽孢杆菌和假单胞菌菌株的重金属抗性机制及相关性状提供了有价值的见解。本文采用的整体方法——同时考察重金属抗性、耐盐性、抗生素抗性、EPS和生物表面活性剂生产以及抗真菌活性——提供了比单独研究单一性状更全面的对细菌适应污染环境的理解。
5. 结论
本研究证明，从金属污染土壤中分离的根际芽孢杆菌和假单胞菌菌株具有多种互补性状，共同支持重金属耐受性和解毒。这些菌株耐受高达500 μg/mL的Cu、Cr和Cd浓度以及高达600 mM的NaCl水平，同时还表现出胞外多糖(EPS)和生物表面活性剂生产、抗生素抗性和抗真菌活性。值得注意的是，解淀粉芽孢杆菌Laica 1对铜和铬表现出最高的抗性，恶臭假单胞菌Laica 4是最耐镉的菌株，并且对Stemphylium botryosum表现出强抗真菌活性（抑制率83.34 ± 2.22%）。这些发现凸显了这些菌株在生物修复和生物防治应用中的潜力。本研究的创新之处在于其整体性研究方法。本文采用的整体方法——将金属抗性与耐盐性、EPS合成、生物表面活性剂生产和抗真菌活性联系起来——提供了比专注于单一性状的研究更全面的对细菌适应污染环境的理解。然而，本研究存在局限性。重金属抗性仅从光密度测量推断，相关机制（EPS、生物表面活性剂、抗生素抗性）通过初步表型测定评估。需要对抗性基因（如czcCBA、cadB、merA）进行分子表征以及对EPS和生物表面活性剂组成进行定量分析，以确认潜在机制。此外，需要在受感染植物上进行体内试验，以验证田间条件下的生物防治效果。
