《Plants》：Identification and Drought-Responsive Expression Analysis of the ZmSPS Gene Family in Maize and Preliminary Investigation of the ZmSPS3 Regulatory Network
Minghao Sun,
Wei Zhao,
Shuai Hou,
Haoxin Meng,
Luyao Wang,
Erna Wu,
Enhao Zhou,
Yuyang Duan,
Yue Wang and
Jianguo Zhang
+ 3 authors
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本研究通过生物信息学方法系统鉴定了玉米蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因家族，并聚焦关键成员ZmSPS3，揭示其在干旱胁迫下的显著上调表达模式及其与蛋白激酶、F-box蛋白的互作关系，为深入解析玉米抗旱的分子调控网络及通过基因工程改善作物水分利用效率提供了重要线索。
引言
玉米（Zea mays L.）是全球种植面积和总产量最大的主要粮食作物之一，也是重要的饲料和工业原料来源。其生长、发育和产量极易受水分、光照、养分供应等环境因素的影响，其中干旱胁迫是严重制约玉米生长和生产的主要非生物胁迫因素。在植物应对干旱的过程中，蔗糖不仅是光合作用的主要产物和能量来源，也是参与渗透调节和信号传导的关键分子。蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase, SPS）是调控植物碳分配和胁迫耐受性的关键限速酶，催化尿苷-5′-二磷酸葡萄糖（UDPG）与果糖-6-磷酸（F-6-P）反应生成蔗糖-6-磷酸（Suc-6-P），是蔗糖生物合成的中心催化步骤。在高等植物中，SPS基因家族可分为A、B、C、D四个亚家族，其中D亚家族目前仅在单子叶禾本科植物中发现，表现出一定的物种特异性。然而，目前针对玉米SPS基因的功能和调控机制研究仍不够系统。
ZmSPS基因家族的鉴定与理化性质分析
本研究采用生物信息学方法，系统鉴定了玉米中的SPS基因家族成员。通过结合已报道研究和SPS的隐马尔可夫模型（HMM）谱（PF00534, PF00862, PF05116）搜索玉米全基因组，并以已知的水稻SPS成员查询玉米蛋白序列，最终确认了7个ZmSPS基因，并根据它们在染色体上的物理位置命名为ZmSPS1-7。对它们编码的蛋白质分析显示，其编码序列（CDS）长度在2532 bp（ZmSPS7）到3237 bp（ZmSPS1）之间，对应的蛋白质长度范围为844至1079个氨基酸。预测的分子量在94.50到119.42 kDa之间，表明家族成员间具有高度的结构保守性。所有ZmSPS蛋白的亲水性平均（GRAVY）值均为负值，表明该家族成员整体上是亲水的。亚细胞定位预测显示，所有7个ZmSPS蛋白均定位于细胞质，这与蔗糖合成主要发生在细胞质中的生理作用一致，进一步支持了ZmSPS基因在玉米碳代谢中的关键作用。
基因结构与保守基序分析
为了深入研究玉米SPS基因家族的进化关系和结构特征，构建了ZmSPS蛋白的系统发育树，并综合分析了保守基序和基因结构。系统发育分析表明，7个ZmSPS成员可被清晰地划分为三个主要的进化枝。进化枝I包括ZmSPS5、ZmSPS7和ZmSPS4；进化枝II仅包含ZmSPS3，显示出相对独立的进化位置；进化枝III则包括ZmSPS2、ZmSPS1和ZmSPS6。保守基序分析表明，ZmSPS家族成员普遍具有高度保守的结构特征，所有蛋白都包含大部分相同的基序，且这些基序的排列顺序在不同成员间高度一致，反映了进化过程中强大的结构稳定性。但不同进化枝间也观察到特定的基序差异，呈现出枝系特异性模式。例如，进化枝III的成员（ZmSPS1, ZmSPS2, ZmSPS6）在C端独特地包含基序11，而进化枝I和II中则没有。基因结构分析显示，所有ZmSPS基因都包含多个外显子和内含子，但数量各异。总体而言，同一进化枝内的基因结构相似，反映了该家族的进化保守性，而不同枝系间的结构差异可能导致了功能分化。
ZmSPS启动子的顺式作用元件分析
为探究玉米ZmSPS基因家族的转录调控机制，本研究提取了所有7个ZmSPS基因起始密码子（ATG）上游2000 bp的序列进行顺式作用元件分析。结果显示，启动子区域富集了与光响应、激素调节、胁迫响应以及生长发育相关的元件。其中，光响应元件（G-Box）、激素响应元件（脱落酸响应元件ABRE）和胁迫相关元件（MYB, STRE, MYC, GC-motif）在所有成员中均有出现。值得注意的是，ABRE元件在ZmSPS1、ZmSPS2、ZmSPS3和ZmSPS5中拷贝数最多，分别有9、9、7和8个，表明这四个基因可能在ABA介导的非生物胁迫响应中发挥核心作用。光响应核心元件G-Box在ZmSPS1和ZmSPS2的启动子中高度富集，分别有8个和9个拷贝，这与SPS在光合产物代谢中的作用一致。ZmSPS1也含有相对较多的STRE元件。总体而言，ZmSPS启动子中ABRE和G-Box元件的高度富集表明，该基因家族的转录调控主要受光和ABA信号驱动。
染色体分布与共线性分析
为了阐明玉米ZmSPS基因家族的物理位置和扩张机制，利用TBtools软件对所有7个ZmSPS基因进行了染色体定位和种内共线性分析。结果显示，ZmSPS基因不均匀地分布在6条染色体上，位于chr3、chr4、chr5、chr6、chr8和chr9。值得注意的是，chr4含有两个成员（ZmSPS2和ZmSPS3），而其他染色体各携带一个成员。种内共线性分析表明，ZmSPS基因家族的扩张主要依赖于跨染色体的片段重复。共识别出三对清晰的复制基因对：ZmSPS4-ZmSPS5（chr5-chr6）、ZmSPS1-ZmSPS6（chr3-chr8）和ZmSPS5-ZmSPS7（chr6-chr9）。有趣的是，ZmSPS5与ZmSPS4和ZmSPS7均存在共线性关系，这三个基因在系统发育树中同属进化枝I，反映了高度的进化保守性。这些结果表明，ZmSPS家族的扩张与玉米的全基因组复制（WGD）事件密切相关。对共线性基因对的非同义替换率（Ka）、同义替换率（Ks）及其比值（Ka/Ks）的计算结果显示，所有识别出的基因对Ka/Ks值均小于1.0，范围在0.1133到0.2798之间，表明ZmSPS基因家族在进化过程中经历了强烈的纯化选择，家族成员倾向于保留其原始氨基酸序列以维持作为蔗糖合成关键酶的功能稳定性。
SPS基因家族的物种间共线性分析
为探究玉米ZmSPS基因家族的进化保守性和物种间同源性，本研究对拟南芥、水稻和大麦进行了共线性分析。结果显示，ZmSPS基因在单子叶和双子叶植物中均高度保守，而在禾本科植物内部则观察到更复杂的扩张模式。与拟南芥相比，仅检测到一个显著的直系同源对：玉米chr6上的ZmSPS5与拟南芥chr5上的AT5G11110.1存在共线性。相比之下，玉米与水稻或大麦之间观察到了更广泛的共线性关系。在水稻中鉴定出四个直系同源基因对，玉米chr3、chr4和chr6上的基因分别对应于水稻的相应染色体。值得注意的是，禾本科中的ZmSPS基因表现出清晰的一对多扩张模式。例如，玉米chr6上的ZmSPS5对应于水稻中的两个转录本（Os02t0184400-01和Os06t0643800-01），以及大麦的chr6和chr7，而chr3和chr4上的基因则对应于水稻和大麦中的单个直系同源基因。这种分布模式反映了禾本科植物内部既有扩张也有保守。chr6上的ZmSPS5是所有比较物种中唯一存在共线性的成员，表明它可能代表了ZmSPS家族的一个核心祖先基因。相比之下，chr3和chr4上的SPS成员仅与水稻和大麦存在共线性，但在拟南芥中缺失，表明这些基因可能是在单子叶植物或禾本科早期进化过程中通过片段复制产生，随后被稳定遗传下来。
玉米ZmSPS基因家族的系统发育分析
基于玉米、水稻、拟南芥和烟草的SPS蛋白序列构建了系统发育树，以明确ZmSPS家族成员的进化位置和关系。分析显示，四个物种的SPS蛋白被分为四个主要类群（Group I–IV），呈现出清晰的单子叶-双子叶分化模式。类群I（黄色分支）包括玉米ZmSPS1和ZmSPS6，以及水稻OsSPS1，表明在单子叶植物内部高度保守。类群II（粉色分支）包含ZmSPS2，它与拟南芥的AtSPS_B以及烟草和水稻的相应蛋白聚在一起，暗示了潜在的功能分化。类群III（蓝色分支）主要包括拟南芥、烟草和水稻的成员，未检测到玉米ZmSPS成员，暗示在玉米进化过程中可能发生了丢失或功能退化。类群IV（绿色分支）是最大的亚群，包括玉米ZmSPS3、ZmSPS4、ZmSPS5和ZmSPS7。该组中的玉米成员与水稻OsSPS成员形成了紧密的姊妹关系，反映了禾本科家族内部的高度同源性。系统发育树进一步揭示了清晰的物种聚类模式：在所有包含玉米成员的分支中，ZmSPS优先与水稻OsSPS聚类，这与之前观察到的物种间共线性结果一致，进一步证实了玉米与水稻SPS基因之间密切的进化关系和高度的保守性。
玉米ZmSPS基因家族的miRNA介导调控网络分析
为探究玉米ZmSPS基因家族的转录后调控，本研究对7个ZmSPS成员进行了miRNA-靶标调控网络预测和构建。结果显示，该基因家族受到多种miRNAs的广泛调控，形成了一个高度互联的多对多网络，其中单个miRNA可以靶向多个ZmSPS基因，而每个ZmSPS基因又可以被多个不同的miRNA调控。共鉴定出34种不同的miRNAs，突显了该家族复杂的转录后调控格局。网络分析揭示了基因间的差异调控。ZmSPS6、ZmSPS5和ZmSPS1位于网络核心，与多种miRNA（如zma-miR167、zma-miR159和zma-miR160家族的成员）相互作用。此外，还观察到一些特异性的调控互作，例如ZmSPS1受zma-miR397a-5p调控，ZmSPS3受zma-miR1432-5p调控，表明这些特异性互作可能有助于在特定组织或发育阶段实现功能分化。
玉米ZmSPS基因家族的GO功能富集分析
为阐明ZmSPS家族成员在玉米生长、发育和代谢调控中的生物学功能，对7个已鉴定的成员进行了基因本体（GO）富集分析。在分子功能（MF）层面，该家族基因主要与催化活性相关，最显著富集的术语是蔗糖磷酸合成酶活性。此外，ZmSPS基因在UDP-糖基转移酶活性和葡萄糖基转移酶活性上也显著富集，反映了它们利用UDP-葡萄糖催化蔗糖磷酸合成的生化作用。在生物过程（BP）层面，ZmSPS基因参与了从基础代谢到复杂发育事件的多个过程。它们显著富集于诸如分泌和花蜜分泌等过程，突显了其在碳水化合物分配和花蜜形成中的核心作用。此外，ZmSPS基因还参与细胞外结构组织、细胞外基质组装和花粉壁组装。一些成员在涉及形态发生的细胞组分组装中富集，表明蔗糖不仅作为能源，也作为构建细胞壁相关结构的前体。
玉米ZmSPS基因家族组织表达模式分析
利用玉米转录组数据，分析了7个ZmSPS家族成员在不同组织和发育阶段的表达模式。结果揭示了家族成员间显著的功能分化，表明它们通过分工协作协调调控玉米代谢。ZmSPS2和ZmSPS6在叶片发育过程中表现出高度协调的表达。这两个基因在V5阶段的叶尖、V9阶段、VT阶段的成熟叶片以及R2阶段的叶片中均保持非常高的转录水平，表明它们是叶片中蔗糖合成的核心基因，支持植株生长和籽粒灌浆。ZmSPS3在未成熟组织发育过程中表现出组织特异性表达，在V9未成熟叶片中达到峰值。类似地，ZmSPS5在大多数组织中表达量普遍较低，但在V9未成熟叶片中表达相对较高，暗示其在早期叶片发育中的特定调控作用。在种子萌发和早期发育阶段，ZmSPS1和ZmSPS7表现出显著的特异性。ZmSPS1在授粉后10天（10 DAP）的全种子中表达最高，主要参与早期籽粒发育过程中的糖分积累和分配。ZmSPS7在萌发24小时的种子中表达最高，表明其在种子萌发过程中的养分动员和能量供应中发挥作用。ZmSPS4在大多数组织中表达相对较低。尽管所有成员都属于同一基因家族，但它们的表达在不同组织和发育阶段存在显著差异：ZmSPS2和ZmSPS6在叶片中高表达；ZmSPS3在未成熟叶片中相对富集，而ZmSPS5在幼叶中呈现局部富集；ZmSPS1和ZmSPS7在籽粒发育和萌发期活跃；ZmSPS4通常表达较低，可能仅在特定条件下被诱导。
干旱胁迫下ZmSPS基因家族转录组表达分析
为评估玉米SPS基因家族在干旱胁迫下的响应性，分析了干旱处理植株的转录组数据，检测了7个ZmSPS成员在轻度（-0.2 MPa）和重度（-0.8 MPa）聚乙二醇（PEG）处理6小时和24小时后的表达模式。结果揭示了家族成员在响应干旱时存在显著的表达差异：ZmSPS3在干旱胁迫下持续表现出高表达。其转录水平在所有处理和对照中都高于其他家族成员，并且表达量随时间显著增加，在轻度和重度胁迫处理24小时后均达到峰值，表明ZmSPS3是干旱响应中的关键调控基因。进化枝成员ZmSPS2、ZmSPS5和ZmSPS7表现出动态的响应模式。ZmSPS2在整个处理期间保持相对稳定，仅在重度胁迫24小时后观察到轻微上调。ZmSPS5和ZmSPS7在轻度胁迫处理6小时和24小时后均呈现上升趋势，尤其在24小时后更为明显。低敏感性成员ZmSPS1、ZmSPS4和ZmSPS6在所有处理下表达量普遍较低。这些发现表明，ZmSPS家族成员在空间表达和对非生物胁迫的响应方面存在相当大的多样性。
PEG诱导渗透胁迫下ZmSPS基因家族的RT-qPCR验证
为验证ZmSPS基因在渗透胁迫条件下的表达模式，通过RT-qPCR分析了PEG处理0-48小时期间7个ZmSPS家族成员的相对表达水平。结果揭示了ZmSPS基因间不同的时间表达模式。其中，ZmSPS3对胁迫处理的响应最为显著，其表达在6小时迅速增加，在12小时达到峰值（约是对照的8.5倍），并在24小时和36小时保持相对较高水平。ZmSPS7显示出相似的趋势，在12小时达到最高表达（约6倍）后逐渐下降。ZmSPS5表现出早期诱导，在3小时达到峰值（约3倍）后逐渐降低。ZmSPS6在6小时出现短暂增加（约2倍），随后恢复到较低水平。相比之下，ZmSPS1在整个处理期间变化极小。ZmSPS2在3-6小时略有增加，但在12小时后显著下降。ZmSPS4在干旱初期受到抑制，但在12小时出现部分恢复。总体而言，RT-qPCR结果与转录组分析基本一致，表明ZmSPS家族成员在响应渗透胁迫时表现出不同的动态表达模式。
ZmSPS3酵母双杂交（Y2H）文库筛选
基于转录组数据，ZmSPS3在干旱胁迫下表现出强烈的诱导表达特性。随后的RT-qPCR分析也显示ZmSPS3和ZmSPS7均呈现表达上升趋势，其中ZmSPS3的响应最为显著。综合转录组和RT-qPCR结果，本研究最终选择ZmSPS3作为后续研究的目标基因。对诱饵载体pGBKT7-ZmSPS3的自激活测试表明，其不具备转录自激活活性，适合进行后续Y2H筛选。将pGBKT7-ZmSPS3诱饵与玉米Y2H文库共转化，并在选择性培养基上进行筛选。初步筛选和复筛获得了可靠的阳性克隆。对阳性克隆的PCR验证显示插入片段大小主要在500到1000 bp之间，符合文库质量标准。对条带清晰的克隆进行测序，获得了多个有效序列。通过同源性比对和功能注释，鉴定出多个可能与ZmSPS3相互作用的候选蛋白。
ZmSPS3与候选蛋白的酵母双杂交验证
为进一步验证Y2H文库筛选结果的可靠性，进行了成对酵母双杂交实验，以检测ZmSPS3与候选蛋白（一个蛋白激酶Zm00001eb129820、一个F-box蛋白Zm00001eb426160和RABD2C Zm00001eb356710）之间的相互作用。将诱饵载体ZmSPS3-BD分别与候选蛋白的AD载体共转化到酵母细胞中。所有共转化子在双缺（DDO）培养基上均能正常生长。在四缺（QDO）培养基上，这些共转化子继续稳健生长并形成清晰的菌落，表明ZmSPS3与这两个候选蛋白之间存在稳定的相互作用。相比之下，所有阴性对照在QDO培养基上均无法生长，有效排除了自激活或非特异性相互作用。这些结果证明，ZmSPS3可以在酵母细胞中与蛋白激酶和F-box蛋白特异性相互作用。
讨论
玉米SPS基因家族成员的数量先前有报道为6个或7个。本研究系统鉴定出7个成员，主要分布在6条染色体上，编码约120 kDa的蛋白质。所有基因对的Ka/Ks比值远小于1，表明该基因家族在进化过程中经历了强烈的纯化选择。系统发育分析和跨物种共线性分析显示，玉米SPS基因与其他单子叶植物（如水稻和大麦）的SPS基因关系密切，而与双子叶植物（如拟南芥和烟草）的关系较远，这表明玉米SPS基因的功能可能与水稻和大麦高度相似。蔗糖代谢是植物响应非生物胁迫的核心过程。在本研究中，虽然ZmSPS3和ZmSPS7均被胁迫诱导，但ZmSPS3的响应最为突出。值得注意的是，在PEG处理下，ZmSPS3在12小时的表达量比0小时增加了8倍以上。特别值得注意的是，ZmSPS3启动子区富集的胁迫响应顺式元件与其转录响应之间存在强相关性，表明它可能是调节玉米在干旱条件下碳分配和渗透保护剂积累的关键限速基因。
对ZmSPS基因家族启动子区顺式作用元件的分析表明，这些基因不仅含有干旱响应的MBS元件，还富集了多种激素响应元件，如脱落酸（ABA）响应元件ABRE、茉莉酸甲酯（MeJA）响应元件TGACG-motif和生长素响应元件AuxRR-core。ZmSPS启动子中ABRE元件的存在为蔗糖和ABA信号之间的协同提供了分子基础。例如，在葡萄中，蔗糖可以与ABA协同诱导成熟相关基因ASR的表达。ABA信号不仅直接激活ZmSPS转录，由此产生的蔗糖还可能作为第二信使，反馈增强ABA信号通路。正如果实成熟研究所显示的，蔗糖可以通过诱导ABA生物合成基因（VvNCED2）和抑制ABA分解代谢基因（VvCYP707A）来提高ABA水平。这些发现表明，ZmSPS家族可能在多条信号通路中发挥作用，不仅参与蔗糖代谢，还通过与ABA、生长素和其他激素信号通路的相互作用，参与调节植物生长、发育和胁迫响应。
本研究中，酵母双杂交实验验证了ZmSPS3与一个蛋白激酶和一个F-box蛋白发生物理相互作用。这一发现将玉米SPS的研究从单纯的转录调控延伸到了复杂的翻译后调控层面。先前的研究表明，在水稻中，OsCPK17可以磷酸化OsSPS4，参与低温胁迫响应。此外，SPS蛋白中已报道了多个磷酸化位点。基于本研究对ZmSPS3的酵母双杂交文库结果，其与蛋白激酶的相互作用提示了磷酸化修饰的可能性。在进一步的研究中，将采用磷酸化位点预测和蛋白质实验来验证该蛋白激酶与ZmSPS3的相互作用，并阐明其在干旱胁迫响应中的作用。
F-box蛋白是SCF E3泛素连接酶复合体的核心组成部分。ZmSPS3与F-box蛋白的相互作用表明，植物可能通过泛素-蛋白酶体途径精细调控ZmSPS3的降解。此外，蔗糖可以通过F-box蛋白ZEITLUPE调控乙烯信号负调控因子CONSTITUTIVE TRIPLE RESPONSE1（CTR1），从而稳定GIGANTEA（GI）并维持植物的正常昼夜节律。这种机制使得植物在干旱缓解或环境条件变化时，能够迅速降低SPS蛋白丰度，从而防止因蔗糖过度积累引起的反馈抑制或代谢失衡。
然而，本研究也存在一些局限性。首先，PEG处理模拟的渗透胁迫虽然提供了信息，但并未完全复制田间土壤干旱胁迫的生理复杂性。其次，目前对ZmSPS3功能的见解仅限于转录组响应和蛋白质-蛋白质相互作用，缺乏来自生理生化测量（如SPS酶活性和蔗糖含量）以及光合表型数据的直接证据。因此，需要涉及稳定遗传转化和在更现实的干旱条件下进行综合表型鉴定的进一步研究。未来的研究将侧重于评估转基因玉米品系的生长性能和水分利用效率，以全面阐明ZmSPS3在复杂的干旱响应调控网络中的生物学作用。
材料与方法
本研究以玉米自交系B73为实验材料。种子在蒸馏水中浸泡24小时，然后在37°C黑暗培养箱中催芽。发芽后，将幼苗移栽到含有珍珠岩和土壤1:1（v/v）混合物的育苗盆中。植株在可控环境生长室中培养，昼/夜温度为25°C/22°C，光/暗周期为16小时/8小时。当幼苗达到三叶期时，使用12% PEG6000溶液模拟渗透胁迫以模拟干旱条件。在处理后0、1、3、6、12、24、36和48小时采集叶片样品。每个时间点包括三个生物学重复，每个重复重约0.1克，每个生物样品设三个技术重复。所有采集的叶片样品立即在液氮中速冻，然后储存在-80°C用于后续分析。
ZmSPS基因家族的鉴定通过生物信息学方法完成。从Phytozome数据库下载玉米基因组、蛋白质序列和注释文件。首先使用HMMER v3基于SPS家族的隐马尔可夫模型（HMMs）（PF00534, PF00862, PF05116）搜索玉米蛋白质序列，初步鉴定SPS基因家族成员。此外，使用水稻SPS蛋白质序列对玉米蛋白质数据集进行BLASTP搜索，并将结果合并以生成候选基因ID列表。随后使用SMART、NCBI保守结构域数据库（CDD）、Pfam和Phmmer进一步确认候选序列是否含有保守的SPS结构域。丢弃缺乏核心SPS结构域的序列，剩余的序列被指定为最终的ZmSPS基因集。
利用在线工具ProtParam分析ZmSPS蛋白的理化性质。使用DeepLoc-2.0预测SPS蛋白的亚细胞定位。使用MEME Suite 5.59在线工具分析ZmSPS蛋白质序列的保守性，将待识别的基序数量设置为15，基序宽度限制在6到100个残基之间。基于玉米基因组GFF注释文件，提取ZmSPS基因的外显子和内含子分布信息，随后使用适当的可视化工具展示基因结构。
基于玉米全基因组序列和相应的注释文件，提取每个ZmSPS基因起始密码子（ATG）上游2000 bp的序列作为推定的启动子区域。将这些序列提交至PlantCARE在线数据库，用于顺式作用元件的鉴定和功能注释。使用R语言整合和可视化核心顺式元件的分布。此外，使用psRNATarget在线工具预测ZmSPS基因的潜在miRNA靶标。
基于基因组注释信息，使用TBtools v2.376可视化ZmSPS基因在10条
