《Plants》：Applying Target Capture Sequencing to Unravel the Anthurium Section Pachyneurium (Araceae), with Emphasis on Brazilian Species
Mel C. Camelo,
Georgios J. Pappas,
Micheline C. Silva,
Lívia G. Temponi,
Marcus A. N. Coelho,
José F. A. Baumgratz and
Mónica M. Carlsen
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本综述首次利用靶向捕获测序（Hyb-Seq）结合Angiosperms353探针组，对天南星科（Araceae）观叶花烛属（Anthurium）的肥脉组（sect. Pachyneurium）进行了系统发育基因组学分析。研究证实，传统基于莲座状习性、内卷芽前叶、无双汇主脉等形态特征定义的肥脉组并非单系群，其中巴西物种可划分为三个地理结构显著且获得强力支持的谱系，揭示出关键形态性状存在同塑性演化。该研究为修订该巨型属的属下分类提供了基因组学框架，并为受威胁的新热带生物群系的保护工作提供了进化依据。
1. 引言
天南星科（Araceae）包含约150个属、超过4600个物种，而观叶花烛属（Anthurium）是其中物种最丰富的新热带属之一，约有1300个物种。尽管其多样性极高，但该属的分类学处理极具挑战性。目前的属下分类主要依据形态特征，将物种划分为20个组，但先前的系统发育评估表明，仅有少数几个组是单系群，这揭示了基于形态的分类学与进化历史之间存在不一致性。
这种不一致性在肥脉组（sect. Pachyneurium）中尤为明显。该组依据其莲座状（rosulate）习性、内卷（involute）的芽前叶（prefoliation）以及无双汇主脉（collective vein absent）的脉序而被定义为一个形态上独特的类群。在巴西，该组记录有21个分类单元，在亚马逊、大西洋森林、卡廷加和塞拉多等地区表现出显著的多样性。然而，先前使用少量质体和核基因标记的系统发育研究，因遗传变异和系统发育信号有限，未能清晰解析物种层面的关系，且该组的单系性尚未通过综合取样得到检验。
为解决观叶花烛属这类巨型多样性类群的系统关系，需要系统发育基因组学数据来克服少量标记的局限性。靶向捕获测序（Target Capture Sequencing，或称Hyb-Seq）技术可以从数百个保守位点富集序列，即使是来自馆藏标本的材料也能应用。Angiosperms353探针组已成功应用于多个具有复杂辐射演化历史、包括天南星科其他属的单子叶植物谱系研究中，这表明其具备解析观叶花烛属属下关系的潜力。
本研究首次对观叶花烛属肥脉组（重点关注巴西物种）进行了系统发育基因组学分析。我们的目标是：(1) 使用Hyb-Seq和Angiosperms353探针组生成基因组数据集；(2) 重建肥脉组的系统发育树并检验其单系性；(3) 估算该属及其主要谱系的起源分化时间。基于先前的形态学和分子证据，我们假设肥脉组并非单系群，且巴西物种会形成反映其进化历史的地理结构化谱系。
2. 材料与方法
2.1. 分类单元取样与基因组DNA提取
本研究共取样了36个天南星科物种，其中35个为观叶花烛属物种（涵盖14个组），并以崖角藤属的Pothos scandens作为外类群。在观叶花烛属物种中，有18个属于肥脉组。我们的取样包括了11个分布于巴西的物种，占该组巴西物种的52%。为确保命名的准确性，我们将肥脉组的模式种A. crenatum纳入取样。所有样品均来自2019-2020年在巴西主要生物群落实地考察采集的新鲜叶片，或来自植物园活体收集。总DNA从硅胶干燥的叶片组织中提取。
2.2. 文库制备、靶向富集与测序
使用NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit构建基因组文库。利用通用的Angiosperms353探针试剂盒进行液相杂交捕获以实现靶向富集。富集后的文库在Illumina NovaSeq 6000 S4系统上进行测序，生成150 bp双端读长。
2.3. 捕获测序数据处理
原始测序读数经质量修剪后，针对从参考数据库中获取的五个观叶花烛属物种的Angiosperms353单拷贝同源基因集，进行靶向组装。为确保数据质量和正交性，应用了多阶段过滤流程，最终获得一个包含94个位点（占原始位点集的27.98%）的最终矩阵，其中一组包含68个高质量位点（20.24%）在至少90%的样本中均能成功回收。
2.4. 系统发育分析
系统发育重建采用了两种广泛使用的互补方法：串联（超矩阵）分析和多物种溯祖模型分析。两种方法均基于过滤后得到的68个核基因位点数据集进行。首先，使用最大似然法为每个基因位点构建独立的基因树。随后，在串联分析中，将每个位点的多重序列比对串联成一个超矩阵，并在RAxML-NG中进行分区最大似然分析。在基于溯祖模型的分析中，则使用ASTRAL-IV软件，以前面重建的单个基因树（对自展支持度低于30%的分支进行折叠处理）作为输入，来推断物种树。
2.5. 分化时间估算
为估算观叶花烛属内部的分化时间，我们基于串联分析推断出的最大似然物种树，在BEAST2软件中使用“化石化出生-死亡模型”生成了一个时间标定的超度量树。共使用了两个基于化石的校准点：根节点的校准基于早期Pothoideae亚科的化石证据（均值=112 Ma，标准差=5 Ma）；冠群Anthurium的校准则基于化石?Petrocardium cerrejonense（年龄在60–58 Ma之间），为其设置了硬最小值约束。
3. 结果
3.1. 基因回收率
测序共产生12.5亿条读长。经过严格的质控过滤后，最终数据集包含36个样本。基因回收率在不同分类单元间存在异质性。虽然大多数亚马逊地区和大西洋森林的物种在多数位点上显示出较高的回收率，但A. paraguayense, A. ernestii和A. salvinii等物种的回收率持续较低。总的基因回收率较低（占目标基因的27.98%），这反映了主要设计自菊类和蔷薇类植物的Angiosperms353探针与观叶花烛属（单子叶植物）之间的进化分歧。尽管如此，使用不同过滤阈值（94 vs. 68个位点）的分析之间，以及串联与溯祖方法之间的一致性和支持度表明，回收的位点提供了足以解析肥脉组内系统发育关系的系统发育信号。
3.2. 系统发育基因组学分析
系统发育基因组学重建为35个观叶花烛属物种（包含18个肥脉组物种）解析出一个基本得到良好解析的系统发育关系。无论是串联分析还是基于溯祖模型的分析，都得到了高度一致的拓扑结构，大部分节点都获得了强大的统计支持。
分析结果表明，肥脉组在传统界定的范围内并非单系群。巴西的物种被稳定地恢复为三个地理结构显著且获得强力支持的谱系：
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亚马逊谱系（绿色）
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大西洋森林谱系（灰色）
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卡廷加/塞拉多谱系（宝蓝色）
其中，传统上被归入肥脉组的大西洋森林谱系，被解析为与A. coriaceum（隶属于Urospadix组）构成姐妹群关系，揭示了一种未被形态学预测的进化关系。卡廷加/塞拉多谱系包括A. affine, A. pluricarinatum和一个未正式发表的新种“A. giuliettiae”，后两者稳定地作为A. affine的姐妹群。包含肥脉组模式种A. crenatum的加勒比/中美洲谱系也获得了强力支持。
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3.3. 时间标定树
基于化石校准的分化时间估算结果与主要、高支持度的系统发育关系一致。分析结果显示，观叶花烛属的冠群年龄大约在6200万年前（95% HPD: 5800-6500万年前），对应古新世。肥脉组内主要谱系的分化事件发生在中新世（约2000-300万年前）。其中，亚马逊谱系的分化大约在中中新世（约1500-1200万年前），大西洋森林谱系的分化大约在中-晚中新世（约1200-800万年前），而卡廷加/塞拉多谱系的分化则从晚中新世延续到上新世（约800-300万年前）。加勒比/中美洲谱系和安第斯谱系的分化也同样可追溯至中新世。
3.4. 对肥脉组系统学和分类学的启示
肥脉组在系统发育上并非单系群，这一发现对该属的属下分类具有重要意义。曾被归入肥脉组的物种分布于多个明显不同的谱系中，这表明传统用于定义该组的形态特征（莲座状习性、内卷的芽前叶、无双汇主脉等）是同塑性的。这种形态上的趋同可能是对相似环境压力（特别是季节性干旱生境）的适应性反应。大西洋森林谱系与Urospadix组的A. coriaceum之间密切的进化亲缘关系表明，在构建该属的系统关系时，历史生物地理学可能与形态学同等重要。本研究结果并非一个正式的分类学修订，而是为未来扩大取样并进行详细形态学重新评估的研究提供了框架。
3.5. 生物地理学启示与巴西谱系的多样化
我们的系统发育所揭示的时空格局，可与南美洲已知的地质气候历史进行对比。肥脉组内三个主要巴西谱系的多样化发生在中新世和上新世（2000-300万年前），这是一个南美洲环境发生显著变化的时期。大西洋森林谱系与亚马逊谱系之间的姐妹群关系，与间断分布假说一致，即一个先前连续的分布区后来发生了破碎化。中新世期间横跨南美洲“干旱对角线”的干旱植被扩张，可能是导致这两个谱系分离的潜在机制。亚马逊谱系内部的多样化时间，与现代亚马逊盆地及其相关湿润森林的巩固时期相吻合。卡廷加/塞拉多谱系代表了更近期的多样化事件，这与南美洲东部的新近纪干旱化进程相符。该谱系物种目前呈间断分布，一些局限于湿润的森林高地，另一些则局限于沿海沙地，这种分布模式与更新世避难所模型是相容的。在巴西之外，加勒比/中美洲谱系和安第斯谱系在中新世的多样化表明，适应类似环境条件的“肥脉组”形态可能在新热带地区的多个谱系中独立演化产生。
3.6. 方法论启示、局限性与保护意义
本研究的主要方法学局限是使用Angiosperms353探针组获得的核基因位点回收率低于预期。尽管如此，回收的位点在大部分节点上都以高支持度解析了肥脉组内的关系，证明通用探针组的部分数据集可以在快速辐射演化的谱系中提供有意义的系统发育信号。本研究每个物种仅使用一个样本，无法捕捉种内变异或隐蔽多样性。基于仅两个化石校准点的分化时间估算，代表了有待未来研究检验的时间假说。此外，不完全谱系分选和杂交对基因树不一致性的潜在影响仍未解决。
尽管存在这些局限性，本研究通过为肥脉组提供一个已解析的系统发育基因组学假说，为解决“达尔文短处”做出了贡献。同时，通过整合系统发育、分化时间和分布数据，开始着手应对“华莱士短处”，为观叶花烛属的间断分布和扩散事件提出了可检验的假说。最后，我们的研究框架为保护工作提供了信息，通过识别进化上独特的谱系，例如在卡廷加/塞拉多谱系中，分布广泛的A. affine与其局限于受威胁生境的、分布狭窄的近缘种（A. pluricarinatum和A. giuliettiaesp. nov. ined.）形成鲜明对比，大西洋森林谱系中也包含濒危物种A. santaritense。这凸显了对这些狭域特有种进行种群水平研究以评估其遗传多样性的必要性。
5. 结论
本研究首次为观叶花烛属肥脉组的巴西物种提供了一个系统发育基因组学假说。结果证实，该组在传统界定下并非单系群；相反，巴西物种形成了三个地理结构清晰的谱系：亚马逊谱系、大西洋森林谱系和卡廷加/塞拉多谱系。大西洋森林谱系与Urospadix组的A. coriaceum构成姐妹群，揭示了一种出人意料的进化关系。这些谱系的分化发生在上新世，恰逢主要的地质气候事件。在分类学上，本研究揭示了莲座状习性和内卷的芽前叶为同塑性性状，为未来修订巴西肥脉组的分类及重新界定属下分组奠定了基础。这项工作是一个更大型项目的一部分，未来将扩展取样至约400个观叶花烛属物种，并开发一个属特异性的探针组，以进一步阐明其进化历史。
