基于EST-SSR标记的刺五加遗传多样性评价与保护育种策略研究

《Plants》：Development and Application of EST-SSR Markers to Assess Genetic Diversity and Structure of Eleutherococcus senticosus for Conservation and Breeding Shikai Zhang, Luwei Ding, Cheruiyot Evans, Eliamani Singo, Jiawei Wu, Guanzheng Qu, Tuya Siqin, Xuefeng Han, Shunjie Zhang and Xiangling You

本文首次基于全长转录组开发了13个高多态性EST-SSR标记，并系统评估了中国东北地区22个自然居群405个个体的遗传多样性。研究发现刺五加物种水平上具有中等遗传多样性，但其变异主要存在于居群内部（66.3%），居群间存在中度分化（Fst=0.21）。研究将居群分为两大遗传谱系，揭示了核心分布区的高基因流（Nm> 10）与边缘居群的显著遗传独特性，为该物种的科学保护、核心种质库构建和未来遗传改良提供了关键的分子工具和科学依据。

　　

1. 引言

刺五加（Eleutherococcus senticosus）是温带森林生态系统中一种重要的药用植物，其根、茎、叶富含三萜、黄酮、多糖和丁香苷等多种生物活性化合物，在药品、功能性食品和保健品领域应用广泛。然而，由于市场需求的增长和监管不足，对野生根茎的破坏性采集导致其自然种群数量锐减，栖息地退化，使这种宝贵的药用植物处于高度濒危状态。刺五加是一种多年生落叶灌木，生长缓慢，自然更新能力差，且存在自交不亲和性，因此过度采伐极易导致其种内遗传多样性丧失，威胁其长期进化潜力。

在此背景下，系统评估刺五加的遗传背景对其保护、可持续利用和遗传改良至关重要。与传统的形态和生理性状评估相比，基于DNA的分子标记能更准确地揭示居群间的遗传差异。其中，表达序列标签-简单序列重复（EST-SSR）标记因其共显性遗传、多态性高、重复性好、开发成本相对较低以及潜在的功能相关性等优势，成为分析遗传多样性和解析种群结构的有力工具。此前针对刺五加的遗传多样性研究相对有限。为填补这一知识空白，本研究基于全长转录组数据开发了一套多态性EST-SSR引物，并利用这些标记对中国东北森林地区22个居群的405个样本进行了系统的遗传多样性、种群结构和分化模式分析。

2. 结果

2.1. EST-SSR位点的鉴定

从刺五加的全长转录组数据中，共鉴定出93,526个EST-SSR位点。其中，单核苷酸重复最为丰富（26,083个位点，占27.89%），其次是复合SSR（25,647个，27.42%）、二核苷酸（16,456个，17.60%）和三核苷酸重复（18,398个，19.67%）。这些位点为开发多态性EST-SSR标记奠定了坚实基础。

2.2. 多态性EST-SSR引物的筛选

通过对开发的引物进行筛选，最终确定了13对具有稳定扩增、条带清晰且多态性高的EST-SSR引物用于后续分析。这13个位点共检测到86个等位基因，平均多态性信息含量（PIC）为0.52，表明所选位点具有中高等多态性。平均期望杂合度（He）为0.43。遗传分化分析显示，居群间存在中度遗传分化（平均F_st= 0.24）。

2.3. 刺五加居群的遗传多样性分析

对22个地理居群（405个样本）的遗传多样性评估显示，刺五加在物种水平上保持了中等遗传多样性（平均He = 0.43）。但不同居群间差异显著：临江（LJ）居群表现出最高的多样性（He = 0.58），而通化（TH， He = 0.31）和辉南（HN， He = 0.32）等边缘居群的遗传多样性较低。此外，靖宇（JA）和庆阳（QY）等居群的固定指数（F）为正值，表明可能存在近交或瓶颈效应。

2.4. 刺五加居群的分子方差分析

分子方差分析（AMOVA）表明，刺五加的总遗传变异主要存在于居群内部（66.3%），居群间的变异贡献了20.3%。居群间的遗传分化系数（F_st）为0.21，达到了极显著水平，证实了居群间存在中度遗传分化。

2.5. 刺五加居群间的遗传距离、遗传一致性与遗传分化分析

根据等位基因频率计算的Nei氏遗传距离和遗传一致性显示，22个居群间存在较大变异。地理上邻近的居群（如饶河RH与虎林HL）遗传距离小、遗传一致度高，而地理距离远或生态差异大的居群（如通化TH与乾安QA）则遗传距离大。对基因流（N_m）的分析进一步揭示，核心分布区内的居群（如饶河RH、鸡西JX、虎林HL）间基因流非常频繁（N_m> 10），遗传同质性高；而一些边缘或隔离居群则表现出显著的遗传独特性，基因流受限。

2.6. 主坐标分析与系统发育分析

基于遗传距离进行的主坐标分析（PCoA）和邻接树构建，均一致地将405个个体（来自22个居群）划分为两大支系。第一组包括9个居群，主要来自黑龙江省中东部；第二组包括其余13个居群，主要来自吉林省东部和黑龙江省南部。这一分组模式得到了后续结构分析的一致性验证。

2.7. 刺五加不同居群的遗传结构分析

使用STRUCTURE软件进行的遗传结构分析，通过ΔK值确定最优遗传簇数K=2。405个个体被清晰地划分为两个遗传簇，其分组结果与PCoA和系统发育分析完全一致，进一步验证了刺五加在东北地区存在两个主要遗传谱系。

2.8. 距离隔离分析

Mantel检验分析了22个居群间遗传距离与地理距离的相关性。结果显示，两者仅存在微弱正相关（r = 0.133），且不显著（p = 0.0798）。这表明地理距离并非驱动刺五加居群遗传分化的主要因素，核心分布区内的高基因流和边缘居群的遗传独特性更可能由地理屏障、扩散限制及遗传漂变等因素共同导致。

3. 讨论

本研究首次基于刺五加全长转录组数据开发并验证了一套多态性EST-SSR标记，其对刺五加种内遗传变异的揭示具有高信息量。遗传多样性评估表明，尽管面临过度采伐，现存刺五加居群仍保留了显著的进化潜力，但多样性在居群间分布极不均匀。临江（LJ）居群作为遗传多样性热点和私有等位基因库，具有极高的保护价值。

AMOVA和成对F_st分析揭示了一种“高居群内变异伴随中度居群间分化”的模式。核心分布区（如饶河RH、鸡西JX、虎林HL所在区域）内居群间基因交流频繁，形成了一个遗传连续的“核心分布区”。与之相对，通化（TH）、乾安（QA）等边缘或隔离居群则表现出高度的遗传分化。值得注意的是，东宁（DN）居群虽不位于地理边缘，却与许多其他居群存在较高的遗传距离，暗示其可能具有独特的进化历史或强烈的局地环境适应。

弱且不显著的距离隔离模式支持了地理距离并非主要驱动力的结论。刺五加居群被清晰地划分为两大遗传簇，这可能对应于不同的历史冰期避难所，例如长白山和小兴安岭-锡霍特山脉地区，并在冰期后发生了范围扩张和二次接触。

基于以上发现，本研究为刺五加的保护、利用和管理提出了科学策略：应将高遗传多样性居群（如LJ）和具有独特遗传背景的居群（如TH、QA、DN）作为优先原位保护地；应系统保存两大遗传谱系的代表性样本，并加强对边缘和高分化区域的种质收集；在育种中，应优先选择来自不同遗传簇（如簇I的JX和簇II的JA）的优良个体进行杂交，以最大化杂种优势潜力。

4. 材料与方法

研究广泛收集了中国东北地区的刺五加种质资源，共获得来自22个居群的405个代表性样本。使用改良的CTAB法从叶片组织中提取基因组DNA。基于已提交至国家生物信息中心（BioProject: PRJCA055497）的全长转录组测序数据，利用MISA工具鉴定SSR位点，并使用Primer 3软件设计引物。经过多轮筛选，最终获得13对多态性EST-SSR引物。使用这13对引物对所有405个个体进行PCR扩增，产物经毛细管电泳分析。利用GeneMarker、GenAIEx、STRUCTURE、PowerMarker等软件进行基因分型、遗传多样性参数计算、AMOVA、PCoA、系统发育树构建、遗传结构分析和Mantel检验等一系列数据分析。

5. 结论

本研究成功开发了13个高多态性EST-SSR标记，并系统评估了中国东北22个地理居群刺五加的遗传多样性与种群遗传结构。结果表明，刺五加在物种水平维持中等遗传多样性，但不同地理居群间变异显著。遗传变异主要存在于居群内部，但居群间也存在中度遗传分化。核心分布区内的居群间基因流频繁，而边缘居群则表现出遗传独特性。所有居群被划分为两大遗传簇，可能与不同的历史避难所有关。东宁（DN）居群表现出独特的遗传特征，需给予特别保护关注。本研究明确了刺五加自然种质资源的遗传背景、变异模式和居群关系，为其种质资源的科学保护、高效收集与保存以及后续杂交育种和优良种质选择奠定了坚实的遗传基础。未来研究可在此基础上，利用这些EST-SSR或连锁的SNP进行功能基因关联研究，对代表性个体进行全基因组重测序以解析种群历史，并整合生态位模型与遗传数据以预测气候变化影响并设计动态保护策略。