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这篇研究通过计算结构模型与分子动力学模拟，系统性分析了HEV（Hepatitis E Virus）pORF1多蛋白多脯氨酸区域（Polyproline Region, PPR）的宿主基因组插入事件。文章发现，这些插入并未改变pORF1的整体稳定性或PPR的无序本质，但显著增加了PPR与MetY结构域及RdRp（RNA-dependent RNA Polymerase）之间的氢键相互作用。作者提出，这种增强的互作可能促使病毒RNA合成更高效，为理解HEV在免疫缺陷个体中增强复制的分子机制提供了新的结构视角。
1. 引言
丙型肝炎病毒（HEV）是一种单股正链RNA病毒，是导致人类急性病毒性肝炎的病原体，并可在免疫缺陷个体中引发慢性感染。2021年，全球约有1947万例急性HEV感染病例，导致3450人死亡，使其成为一个重大的公共卫生问题。HEV基因组包含三个主要开放阅读框（ORFs），其中ORF1编码一个多蛋白（pORF1），该蛋白包含多个参与病毒复制的非结构域，包括MetY结构域、脂肪酸结合域/金属结合域（FABD/MBD）、多脯氨酸区域（PPR）、Macro结构域、解旋酶以及RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）。PPR是一个公认的内在无序区域（IDR），是病毒复制和适应的关键区域，也是宿主基因组插入事件的热点。已有研究表明，携带插入的HEV毒株在体外表现出复制优势，但其潜在的分子机制尚不清楚。
2. 材料与方法
本研究分析了25个HEV毒株的pORF1氨基酸序列，其中9个毒株携带源自宿主基因组的插入（如RNF19A、RPL6、ZNF787等），16个为野生型（WT）毒株。研究首先利用AlphaFold2对pORF1进行结构建模，并通过预测对齐误差（PAE）和预测局部距离差异测试（pLDDT）分数评估模型置信度及内在无序区域。随后，使用Amber22软件对预测结构进行了1微秒的全原子分子动力学（MD）模拟，采用隐式溶剂模型。通过分析均方根偏差（RMSD）、均方根涨落（RMSF）来评估蛋白质的整体稳定性，并特别关注了PPR与其他pORF1结构域之间氢键的形成情况。统计分析采用Mann-Whitney检验比较插入株与野生型毒株的差异。
3. 结果
3.1. 插入的来源与结构
宿主插入的来源多样，包括外显子、5′ UTR、3′ UTR以及假基因。其中，大部分插入序列在原始宿主蛋白中并无明确结构，插入后也未能赋予PPR有序构象。然而，有两个例外：源自核糖体蛋白基因的RPS17和RPL6插入，因其在参考数据库中序列信息丰富且保留了原始蛋白的开放阅读框，被预测能在PPR中形成α-螺旋结构，从而将部分无序区域转变为有序状态。其他插入则未引起PPR无序性质的改变。
3.2. pORF1结构域预测
通过AlphaFold模型的PAE分析，可以清晰识别出pORF1的各个结构域（MetY、FABD/MBD、Macro、解旋酶、RdRp）。PPR由于其内在无序特性，在PAE图上表现为高分值区域。在携带RPS17和RPL6插入的毒株中，插入位点在PAE热图上显示出结构化的低分值区域，这与它们引入有序结构的观察一致。而对于其他不保留结构的插入，则未观察到此类低PAE区域。
3.3. pORF1的稳定性
对1微秒MD模拟轨迹的RMSD和RMSF分析表明，无论是整体pORF1还是其各个结构域（包括PPR），携带插入的毒株与野生型毒株之间的稳定性均无显著差异。所有系统的RMSD中值在1-5 ?之间波动，且置信区间存在重叠。这表明宿主插入事件并未改变pORF1的整体结构稳定性或柔性。
3.4. PPR与pORF1其他结构域间的氢键
氢键分析揭示了关键差异。与野生型毒株相比，携带插入的毒株其PPR内部、以及PPR与MetY结构域和RdRp之间的氢键数量显著增加。例如，在携带RPS17插入的Kernow-C1-p6毒株中，观察到PPR与MetY、PPR自身以及Macro结构域之间的氢键增多。对全部毒株的聚合数据分析证实，插入株在PPR自身、PPR-MetY及PPR-RdRp之间的氢键形成均具有统计学意义的增加（p值分别为8.48×10-5、9.89×10-4和0.027）。
3.5. 插入株特异性氢键的定位
通过多序列比对将特异性氢键映射到序列上发现，在MetY结构域中，插入株形成的氢键主要集中在C端区域（第292至437位残基）；而在RdRp中，则主要富集在N端（第1536至1587位）和中心区域（第1653至1676位）。然而，没有单个氨基酸残基在所有插入株中都普遍参与成键，这表明氢键的形成可能取决于插入序列的特性及其引起的局部构象变化。
3.6. 氢键增多区域的稳定性比较
尽管MetY结构域和RdRp与PPR之间的氢键增多，但对这两个结构域的RMSD曼哈顿距离分析显示，插入株与野生型毒株之间并未发现稳定性上的显著差异。这意味着增加的氢键相互作用并未改变这些核心功能域自身的结构稳定性。
4. 讨论
本研究的计算模型表明，除了RPS17和RPL6外，大多数宿主插入并未将PPR从无序状态转变为有序状态，也未改变pORF1的整体稳定性。然而，分子动力学模拟揭示了一个关键现象：插入事件显著增强了PPR与MetY结构域及RdRp之间的氢键网络。
一个有趣的假设由此产生。研究借鉴了基孔肯雅病毒非结构蛋白1（nsp1）形成十二聚体“冠冕”状结构的发现，该结构作为“加帽孔”协调病毒RNA合成。HEV的MetY结构域被认为可能具有类似功能。本研究发现，插入株中增加的氢键主要位于MetY结构域的C端（对应“冠冕”结构的“腰部”和“裙摆”区域）以及RdRp的特定区域。因此，作者推测，PPR与MetY及RdRp之间增强的相互作用，可能有助于将RdRp拉近到由MetY寡聚体形成的代谢物通道附近，从而更有效地定位和利用宿主资源，最终提升病毒RNA的合成效率。这可能是携带插入的HEV毒株表现出复制优势的结构基础。
当然，这一假设需要实验结构的验证。尝试使用AlphaFold3建模pORF1十二聚体结构因计算资源限制未能成功，仅获得了四聚体模型。未来的研究可以关注那些已知会降低复制速率的PPR点突变，通过计算模拟分析这些突变是否会影响上述关键的氢键相互作用。
5. 结论
综上所述，本研究通过对25个HEV pORF1的计算建模和分子动力学模拟，发现宿主基因组插入PPR区域并不会改变该区域的内在无序特性或pORF1的整体稳定性。然而，这些插入事件显著增加了PPR与MetY结构域及RdRp之间的氢键相互作用。这种增强的域间互作，可能通过优化RdRp相对于假定“加帽孔”结构的位置，进而促进更高效的病毒RNA合成，从而解释了插入株的复制优势。最终证实这一机制，有待于pORF1实验性高分辨率结构的解析。
